MiR-21调控人脑胶质瘤生长的实验研究

论文摘要

脑胶质瘤是人类最常见难治性颅内恶性肿瘤,其中高度恶性的胶质母细胞瘤一年生存率仅为46%。近年发现了如EGFR基因过表达、PTEN基因表达缺失、p53基因突变等与该肿瘤发病相关的分子事件;从而认识到胶质瘤的发生是涉及细胞周期演进调控失衡、信号转导通路成员异常表达、凋亡与死亡和细胞代谢紊乱等多种基因功能发生紊乱的病理过程。联合基因治疗是胶质瘤基因治疗的发展趋势。因此,当前关于如何实现同时对多个癌基因或者抑癌基因进行调控成为肿瘤研究的核心问题。MiRNA是一类平均长度为22bp非编码小RNA。MiRNA通过和靶基因3’非翻译区种子序列完全和或不完全互补结合的形式来发挥其转录后水平基因表达的调控作用。每个miRNA具有数十种到甚至更多的蛋白表达调控靶点,而每一种蛋白表达有可能同时受到多个miRNA的调控,目前人类已经发现的四百余种miRNA可以调控三分之一基因的表达水平。MiRNA因此被认为对基因表达起着精细、广泛的调节作用,也成为了肿瘤分子生物学研究领域的新热点。本课题重点研究了胶质瘤中miRNA表达异常,应用反义miRNA寡聚核苷酸转染技术干涉异常表达的miRNA对胶质瘤恶性表型的影响以及和EGFR、PAKT-PI3K信号转导通路的关系及其机制。课题分四部分进行:方法第一部分使用晶芯?哺乳动物miRNA微阵列芯片分析了5个胶质母细胞瘤细胞系和1个星形细胞瘤细胞系miRNA表达谱,筛选出一系列表达升高或者降低的miRNA,其中以miR-21在6个胶质瘤细胞系中表达升高最为均匀一致;并且我们使用Real-time PCR和原位杂交法对5个胶质瘤细胞系、1个正常细胞系、60例胶质瘤标本、10例髓母细胞瘤和6例正常脑组织miR-21表达进一步验证。并采取PCR方法对部分胶质瘤标本扩增miR-21基因组DNA编码区,直接测序,研究了胶质瘤中基因组DNA miRNA的扩增和突变情况。第二部分通过生物信息学手段,建立miRNA靶点选择数学模型,结合现有miRNA靶点数据库对miR-21在胶质瘤发生发展过程中下游候选靶基因进行筛选;克隆含有候选靶基因3’非翻译区全部种子序列的荧光素酶报告载体,对miR-21候选靶基因进行鉴定。第三部分在体外应用反义miRNA寡聚核苷酸转染技术以Oligofectamine介导AS-miR-21靶向miR-21转染U251人脑胶质瘤细胞系后,应用Real-time PCR和原位杂交法对miR-21表达敲低进行检测;并用免疫荧光和Western blot技术检测了miR-21敲低后,PI3K-AKT信号转导通路成员、肿瘤恶性表型相关蛋白、以及我们实验室新近验证的肿瘤生长抑制因子septin-7的表达变化;使用MTT、Annexin V法、流式细胞术及Matrigel 2D、3D生长实验等方法分析了转染前后U251细胞增殖、凋亡、细胞周期分布和侵袭能力的变化。第四部分中则通过建立裸鼠胶质瘤皮下动物模型,瘤内注射Oligofectamine和AS-miR-21混合物,动态观察肿瘤生长情况,检测反义miRNA寡聚核苷酸转染技术敲低U251裸鼠胶质瘤miR-21表达后,PI3K-AKT信号转导通路成员等蛋白表达水平的变化,并且使用TUNEL法检测细胞凋亡,对体外实验的结果进一步验证。结果MiRNA表达谱结果显示:在胶质瘤细胞系中,miR-21等8种miRNA一致表达上调超过正常脑组织的2倍;一致表达下调的miRNA包括miR-127等18种miRNA一致表达下调为正常脑组织的50%以下;Real-time PCR证实,miR-21在胶质瘤中高表达;另外,原位杂交显示在胶质瘤细胞系中miR-21高表达,在60例胶质瘤标本中miR-21表达水平和病理分级正相关,在髓母细胞瘤和正常脑组织中miR-21表达缺失。通过数学模型推测.PTEN和Septin-7是miR-21潜在作用靶点:PTEN基因mRNA得分为93.837,自由度为-7,预测种子序列起始于3’UTR第23个碱基;Septin-7基因mRNA得分为94.0019,自由度为-8,预测种子序列起始于3’UTR第515个碱基。荧光素酶报告实验显示共转染PTEN、Septin-73’UTR的荧光素酶报告载体和AS-miR-21组的荧光值显著高于单转染报告载体组。Real-time PCR和原位杂交结果表明:转染AS-miR-21后可以显著抑制miR-21表达水平。MTT结果显示转染AS-miR-21后细胞增殖率与转染无义ODN和对照组相比明显受抑（P=0.000）,通过免疫荧光和Western blot检测发现EGFR、PI3K-AKT信号转导通路的主要成员表达水平和Bcl-2等肿瘤恶性生物学表型相关蛋白均明显降低,Septin-7、TIMP-1等肿瘤生长抑制因子表达升高。应用Annexin V检测发现转染AS-miR-21组细胞凋亡率明显升高,进一步应用流式细胞术检测细胞周期分布发现细胞周期阻滞于G0/G1期,S期细胞比例降低。成功建立U251和U87胶质瘤细胞系裸鼠皮下肿瘤后,每3天测量一次肿瘤体积,并在肿瘤局部多点注射AS-miR-21和Oligofectamine混合物,发现和对照组、无义对照组相比,AS-miR-21治疗组肿瘤生长缓慢,肿瘤体积差别在观察末期（24天）最显著。应用免疫组化法检测肿瘤标本发现,miR-21表达水平被敲低后,EGFR、PAKT-PI3K等信号转导通路的主要成员（AKT-2、PAKT等）表达水平、肿瘤细胞增殖相关蛋白Ki67、肿瘤凋亡抑制相关蛋白Bcl-2、细胞周期正向演进相关蛋白CyclinD、侵袭相关蛋白MMP-9、均明显降低,Septin-7、TIMP-1等肿瘤生长抑制因子表达升高。应用TUNEL法检测原位细胞凋亡发现AS-miR-21治疗组凋亡细胞核比例明显增加。体内和体外实验的结果一致。结论1.胶质瘤中存在一系列miRNA表达异常,miR-21过表达可以被认为是人脑胶质瘤新的分子标签。2.PTEN、Septin-7基因mRNA的3’UTR是miR-21直接作用靶点。3.Oligofectamine介导转染AS-miR-21可有效敲低miR-21在U251人胶质母细胞瘤细胞系的表达,同时抑制EGFR、PI3K-AKT信号转导通路的活性,上调Septin-7表达,从而抑制了细胞的增殖和侵袭能力,出现G0/G1期阻滞,并诱导细胞凋亡。4.裸鼠皮下胶质瘤模型应用Oligofectamine介导的AS-miR-21治疗,同样可有效敲低miR-21的表达,抑制EGFR、PAKT-PI3K信号转导通路的活性,上调Septin-7表达,从而抑制肿瘤的生长,诱导细胞凋亡,与体外试验结果一致。5.miR-21可成为胶质瘤基因治疗的侯选靶点,反义miRNA寡聚核苷酸转染技术是一项有效的基因沉默技术,具有临床应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词
• 前言
• 第一部分 miR-21在脑胶质瘤中异常表达与PI3K-Akt信号转导通路的关系
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 miR-21抑制Septin-7和PTEN表达调控人脑胶质瘤细胞系生长机制的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 附录
• 第三部分 As-miR-21对U251人脑胶质瘤细胞系生长抑制的体外研究
• 材料方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第四部分 AS-miR-21抑制U251、U87人脑胶质瘤细胞系生长体内研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文与参与科研情况说明
• 综述
• RNAi与肿瘤基因治疗的进展
• 综述参考文献
• 致谢