水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存的研究

论文摘要

随着动物胚胎工程技术的飞速发展，能否挖掘卵巢卵母细胞的潜力，获取更多质量优等的卵母细胞数量越来越成为制约体外受精、核移植、胚胎移植等后续研究发展的问题，卵母细胞冷冻保存的研究则可有效解除上述技术因卵母细胞来源问题受到的时间和空间限制。本研究以水牛卵母细胞为材料，在深入理解快速冷冻保存原理和水牛卵母细胞的结构特点与生长发育规律的基础上，从制约水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存的关键因素入手，结合实验室现有条件，探讨了冷冻载体、冷冻保护剂DMSO及血清、卵丘颗粒细胞、卵母细胞不同成熟阶段和解冻方法对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响，旨在探索科学有效冷冻水牛卵母细胞的方法，并为解决实验室因水牛卵巢来源有限使其它后续研究受到严重制约的问题提供一些有益的参考。现将研究结果简述如下： 1 冷冻载体对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响。以体外成熟培养18h的牛卵母细胞为材料，以A（0.25ml塑料细管）、B（玻璃细管1）、C（玻璃细管2）、D（截取的拣卵针尖端部分）四种细管作为冷冻载体，采用先在10％DMSO+20％FBS的VS1中预处理30s，再在20％DMSO+20％FBS的VS2中处理约30s，冷冻卵母细胞，二步法解冻后补足卵母细胞剩余培养时间并行孤雌激活，统计卵母细胞回收率、形态正常率、成熟率、2—8细胞卵裂率。对照组不经冷冻直接行体外成熟、孤雌激活。研究发现：对照组成熟率、2-4，8细胞卵裂率（68.3％、51.7％、36.1％）均显著高于其它组，表明冷冻对水牛卵母细胞的发育造成很大的损伤。A组卵母细胞解冻后形态正常率、成熟率、2—4细胞，8-细胞卵裂率分别为87.2％、43.9％、34.1％、21.9％，显著低于B（93.8％、51.7％、40.0％、28.3％）、C（94.7％、51.9％、40.7％、27.8％）、D（94.4％、55.9％、41.2％、29.4％）三组，表明A组不适合作为冷冻载体。D组虽然卵母细胞解冻后体外成熟、2—4，8-细胞卵裂率很高，但其卵母细胞解冻后的回收率（69.2％）却显著低于A（87.0％）、B（94.1％）、C（91.9％）组，过低的回收率也使之不适宜作为冷冻载体。B、C组则在卵母细胞解冻后回收率（94.1％ Vs 91.9％）、形态正常率（93.8％ Vs 94.7％）、成熟率（51.7％ Vs 51.9％）、2-4（40.0％ Vs 40.7％），8-细胞（28.3％ Vs 27.8％）卵裂率各项数据上居于A、D之间，且B、C之间无显著差异。综上，B、C两种玻璃细管适合作为水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存的冷冻载体。实验2—6均采

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 1 卵母细胞冷冻保存的发展概况
• 2 卵母细胞玻璃化冷冻保存的原理
• 2.1 卵母细胞冷冻保存的分子机理
• 2.2 卵母细胞玻璃化冷冻保存的原理
• 3 冷冻保护剂
• 3.1 渗透性冷冻保护剂
• 3.2 非渗透性冷冻保护剂
• 3.3 抗冻蛋白（AFP）
• 4 卵母细胞冷冻保存方法
• 4.1 常规冷冻方法
• 4.2 玻玻化冷冻法
• 4.2.1 细管法
• 4.2.2 徽滴法
• 4.2.3 电子显徽镜铜网法（ENG法）
• 4.2.4 开放式拉长细管法（OPS法）
• 4.2.5 玻璃微细管法（GMP法）
• 5 冷冻保存对牛卵母细胞的损伤
• 5.1 冷冻保存对卵母细胞结构的影响
• 5.1.1 对微管的影响
• 5.1.2 对微丝的影响
• 5.1.3 对透明带的影响
• 5.1.4 对卵母细胞超微结构的影响
• 5.1.5 对染色体的影响
• 5.2 玻璃化冷冻保存对牛卵母细胞发育潜力的影响
• 6 影响卵母细胞冷冻保存的因素
• 6.1 卵母细胞外围结构对冷冻效果的影响
• 6.2 卵母细胞脂肪含量对冷冻效果的影响
• 6.3 卵母细胞不同发育阶段的影响
• 6.4 冷冻保护剂种类对冷冻效果的影响
• 6.5 冷冻方法对冷冻效果的影响
• 7 卵母细胞玻璃化冷冻的研究意义和展望
• 第二篇 试验研究
• 引言
• 论文正文
• 1 材料与方法
• 1.1 主要药品、试剂及仪器设备
• 1.1.1 主要药品与试剂
• 1.1.2 主要仪器设备
• 1.2 试剂的配制
• 1.3 方法
• 1.3.1 水牛卵母细胞的收集
• 1.3.2 水牛卵母细胞的体外成熟
• 1.3.3 水牛卵母细胞的玻璃化冷冻
• 1.3.4 水牛卵母细胞的解冻
• 1.3.5 水牛卵母细胞体外受精、孤雌激活及早期胚胎培养
• 1.3.6 水牛卵母细胞玻璃化冷冻效果的评定
• 1.3.7 试验设计
• 1.3.8 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 冷冻载体对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响
• 2.2 渗透性冷冻保护剂DMSO对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响
• 2.3 血清（20％FBS）对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响
• 2.4 卵丘颗粒细胞对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响
• 2.5 卵母细胞不同成熟阶段对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响
• 2.6 解冻方法对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响
• 3 讨论
• 3.1 冷冻载体对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响
• 3.2 渗透性冷冻保护剂DMSO对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响
• 3.3 血清（20％FBS）对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响
• 3.4 卵丘颗粒细胞对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响
• 3.5 卵母细胞不同成熟阶段对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响
• 3.6 解冻方法对水牛卵母细胞快速玻璃化冷冻保存效果的影响
• 4 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
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