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芽孢杆菌属β-甘露聚糖酶产生菌的分离、鉴定、酶学特性及基因克隆的研究

2020-12-06阅读(414)

芽孢杆菌属β-甘露聚糖酶产生菌的分离、鉴定、酶学特性及基因克隆的研究

论文摘要

甘露聚糖是广泛存在于自然界的一种非淀粉多糖,是以β-1,4-D-吡喃甘露糖苷键连接的线状多糖,β-甘露聚糖及其衍生物溶于水后可形成凝胶状,具有高亲水性,易膨胀,使消化道内容物具有较强的黏性,抵制肠道的蠕动,影响消化,单胃动物肠道中不能分泌相关的消化酶,导致了β-甘露聚糖及其衍生物不能被消化分解,从而其不但不能被动物体作为营养成分利用,此外,表面带负电荷的β-甘露聚糖在溶液中极易与带相反电荷的养分物质结合,影响营养成分的吸收,最终对动物的生长及生产性能造成负面影响。β-甘露聚糖酶是一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露聚糖的内切酶,属于半纤维素酶类。β-甘露聚糖酶可将植物胶中甘露聚糖主链的β-1,4糖苷键水解成具有生理功能的甘露低聚糖,消除甘露聚糖的抗营养作用,而且其产物能显著的促进人体和动物肠道内以双歧杆菌为代表的有益菌群的增殖,增进消化系统功能,降低病原菌的致病力,调节机体免疫系统,提高动物免疫力。本课题采用连续富集培养的方法,有效地从云南曲靖魔芋种植田中分离筛选到产β-甘露聚糖酶的优良菌株,并在此基础上对菌株进行了分类鉴定、发酵条件优化、酶学特性、分子克隆及其应用等方面的研究。1、以魔芋精粉作为唯一的碳源和氮源,对采集自魔芋种植田中的土样进行了连续富集培养,最终分离到37株（CD1-CD37）能在含魔芋精粉的平板上形成明显透明圈的菌株。对CD-3、CD-6、CD-9、CD-10、CD-23和CD-25这六株菌进行了培养特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析等方面的鉴定,综合以上鉴定结果,最终将这六株菌鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。2、选择初始酶活和酶学特性均比较好的菌株CD-3和CD-6进行发酵条件的优化,最终分别得到两株菌的最佳产酶培养基及培养条件。CD-3的最佳发酵培养基为（g/L）：魔芋精粉4.5,酵母膏0.75,NaNO3 0.5,MgSO4·7H2O 0.02,K2HPO40.5,pH7.0,在250mL三角瓶里装发酵培养液30mL,37℃,接种量3%,180rpm,摇瓶发酵培养20h。在此培养条件下该菌株产β-甘露聚糖酶的最高酶活可达332.55U／mL。菌株CD-6的最佳发酵条件为（g/L）：魔芋精粉3.0,牛肉膏1.5,NaNO30.5,MgSO4·7H2O0.02,K2HPO40.5,pH6.5,在250mL三角瓶里装发酵培养液30mL,37℃,接种量5%,180rpm,摇瓶发酵培养16h。在此培养条件下该菌株β-甘露聚糖酶的最高酶活可达408.39U／mL。3、通过PCR扩增的方法,分别从菌株CD-3、CD-6、CD-9、CD-10、CD-23和CD-25中得到六条扩增产物。经测序后,将测序结果提交至Genbank数据库中并获得登录号。BLASTN同源性比对分析发现,除菌株CD-6之外,其他5条基因均与Genbank中Bacillus subtilis的β-甘露聚糖酶基因序列有最大同源性,且均在98%以上,而菌株CD-6所产酶与Bacillus sp.5H所产的β-甘露聚糖酶基因具有最大同源性,但仅为70%。然后利用DNAStar软件对已测六条序列进行对比分析,并找出其最大开放读码框（ORF）,将ORF所编码的氨基酸分别在Genbank中进行BLASTP同源性比对,发现六条氨基酸序列均与芽孢杆菌属来源的β-甘露聚糖酶氨基酸序列有最大同源性,除菌株CD-6与Bacillus sp.5Hβ-甘露聚糖酶氨基酸序列的同源性为72%外,其余5株菌的均在99%以上。并且还发现六条氨基酸十分保守,相似度最高的为CD-3和CD-10的氨基酸序列,为99.5%。在这些保守序列中必然存在与β-甘露聚糖酶的特异性功能相关的区域。4、对六株芽孢杆菌属菌株所产的β-甘露聚糖酶的酶学特性比较发现不同来源的β-甘露聚糖酶的酶学特性存在差异,所研究的六株芽孢杆菌属菌株所产的β-甘露聚糖酶的最适温度从45-65℃不等,最适pH范围从5.0-6.5不等,差异显著。六种β-甘露聚糖酶的米氏常数Km和最大反应速度Vm值、比活力和等电点也都有所差异。但是对底物专一性要求差异不大,均以富含甘露聚糖的魔芋精粉或槐豆胶为最适底物,均具有水解甘露聚糖的功能,并对蛋白一级结构与酶学特性的相关性进行推测。5、最后以云南地区较为丰富的魔芋精粉为原料,利用实验室自主研发的菌株CD-3所产的β-甘露聚糖酶,对制备魔芋低聚糖的的工艺条件进行了分析和优化,发现各因素对还原糖转化率的影响程度不同,酶添加量〉酶解时间)酶解pH〉酶解温度,且最佳条件为酶添加量0.75U/g, pH5.5,60℃条件下,酶解时间3h,在此条件下还原糖转化率可达到54.6%。且对酶解产物的硅胶薄层层析分析后发现,酶解产物中多为2糖以上的分子,没有单糖产生,这与已报道的的结果相符。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  • 1.1 甘露聚糖及β-甘露聚糖酶的研究概况
  • 1.1.1 甘露聚糖酶简介
  • 1.1.2 β-甘露聚糖酶简介
  • 1.1.3 β-甘露聚糖酶的结构和作用机制
  • 1.1.4 β-甘露聚糖酶的分子生物学研究
  • 1.1.5 β-甘露聚糖酶的应用前景
  • 1.1.6 魔芋甘露低聚糖的应用
  • 1.2 研究的目的和意义
  • 1.3 研究内容
  • 参考文献
  • 第2章 β-甘露聚糖酶产生菌的分离筛选及菌株的初步鉴定
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 分离源
  • 2.1.2 主要试剂及仪器
  • 2.1.3 培养基
  • 2.1.4 产β-甘露聚糖酶菌株的富集培养和分离筛选
  • 2.1.5 菌株酶活力的测定
  • 2.1.6 酶学性质筛选
  • 2.1.7 β-甘露聚糖酶菌株的初步鉴定
  • 2.2 实验结果与分析
  • 2.2.1 D-甘露糖含量标准曲线的绘制
  • 2.2.2 β-甘露聚糖酶菌株产生菌的富集、分离与筛选
  • 2.2.3 酶学性质筛选
  • 2.2.4 产β-甘露聚糖酶菌株的初步鉴定
  • 2.3 本章小结
  • 参考文献
  • 第3章 β-甘露聚糖酶产生菌CD-3、CD-6发酵条件优化研究
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 菌种
  • 3.1.2 主要试剂及仪器
  • 3.1.3 培养基
  • 3.1.4 菌株的发酵及酶液的制备
  • 3.1.5 B-甘露聚糖酶活力测定
  • 3.1.6 菌株发酵产酶条件的优化
  • 3.2 结果与分析
  • 3.2.1 最佳碳源及其单因子分析
  • 3.2.2 最佳氮源及其单因子分析
  • 3.2.3 添加其他金属离子及表面活性剂对菌株发酵产酶的影响
  • 3.2.4 不同初始PH对菌株产酶的影响
  • 3.2.5 接种量对菌株产酶的影响
  • 3.2.6 装液量对菌株产酶的影响
  • 3.2.7 不同发酵温度、发酵时间对菌株产酶的影响
  • 3.2.8 正交实验优化产酶条件
  • 3.3 本章小结
  • 参考文献
  • 第4章 六株芽孢杆菌属来源的β-甘露聚糖酶基因克隆与其氨基酸序
  • 4.1 实验材料
  • 4.1.1 菌株来源
  • 4.1.2 主要仪器和设备
  • 4.1.3 主要的生化和分子生物学试剂
  • 4.2 实验方法
  • 4.2.1 菌株的液体发酵
  • 4.2.2 细菌总DNA的提取（CTAB法）
  • 4.2.3 PCR扩增β-甘露聚糖酶基因
  • 4.2.4 PCR产物与T载体的连接转化
  • 4.2.5 试剂盒提取重组质粒
  • 4.2.6 重组质粒的测序及序列分析
  • 4.3 结果分析
  • 4.3.1 基因组DNA的提取
  • 4.3.2 β-甘露聚糖酶基因及序列分析
  • 4.3.3 β-甘露聚糖酶氨基酸序列对比分析
  • 4.3.4 蛋白结构的分析及同源模建
  • 4.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第5章 酶学特性及动力学研究
  • 5.1 实验材料
  • 5.1.1 菌种
  • 5.1.2 主要试剂及仪器
  • 5.1.3 培养基
  • 5.1.4 菌株的发酵及酶液的制备
  • 5.1.5 β-甘露聚糖酶活力测定及定义
  • 5.2 实验方法
  • 5.2.1 菌株产β-甘露聚糖酶酶学特性
  • 5.2.2 酶的底物亲和性及动力学比较研究
  • 5.2.3 β-甘露聚糖酶比活力测定
  • 5.2.4 等电点测定
  • 5.3 结果与分析
  • 5.3.1 酶反应的最适温度及温度耐受性
  • 5.3.2 酶反应的最适pH与pH耐受性
  • 5.3.3 金属离子对酶稳定性的影响
  • 5.3.4 酶的底物亲和性及动力学比较研究
  • 5.3.5 比活力的测定
  • 5.3.6 等电点的测定
  • 5.4 讨论
  • 5.5 本章小结
  • 参考文献
  • 第6章 魔芋低聚糖的酶法制备工艺初步研究
  • 6.1 实验材料
  • 6.1.1 酶液
  • 6.1.2 主要试剂及仪器
  • 6.1.3 培养基
  • 6.2 实验方法
  • 6.2.1 β-甘露聚糖酶酶活测定（DNS法）
  • 6.2.2 魔芋精粉粘度的测定
  • 6.2.3 魔芋精粉水解产物还原糖浓度的测定
  • 6.2.4 影响还原糖转化率的单因素分析
  • 6.2.5 β-甘露聚糖酶酶解产物的薄层层析
  • 6.3 结果与分析
  • 6.3.1 β-甘露聚糖酶酶活力测定
  • 6.3.2 β-甘露聚糖酶对魔芋精粉粘度的影响
  • 6.3.3 影响酶解效率的单因素分析
  • 6.3.4 硅胶薄层层析检测酶解产物
  • 6.4 本章小结
  • 参考文献
  • 第7章 研究结果总结及展望
  • 7.1 研究的主要成果
  • 7.1.1 β-甘露聚糖酶产生菌的分离筛选及菌株的初步鉴定
  • 7.1.2 β-甘露聚糖酶产生菌CD-3、CD-6发酵条件的优化
  • 7.1.3 六株芽孢杆菌属来源的β-甘露聚糖酶的基因克隆及氨基酸序列分析
  • 7.1.4 酶学特性及动力学研究
  • 7.1.5 魔芋甘露低聚糖的酶法制备工艺研究
  • 7.2 创新
  • 7.3 后续的研究展望
  • 附录
  • 附录1 实验中所使用的常用试剂的配制
  • 附录2 16S rDNA序列测序结果
  • 附录3 芽孢杆菌属菌株β-甘露聚糖酶基因序列
  • 附录4 不同来源的六条β-甘露聚糖酶基因序列同源性比对结果
  • 附录5 芽孢杆菌属菌株β-甘露聚糖酶氨基酸序列
  • 附录6 芽孢杆菌属菌株β-甘露聚糖酶氨基酸序列在Genbank中同源性比较结果（BLASTP）
  • 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果
  • 致谢

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