论文摘要
目的:建立子宫内膜异位症动物模型和大鼠原代培养垂体细胞模型,探讨诺美孕酮对子宫内膜异位症的药效作用和作用机制。方法:1.体外释放实验测定诺美孕酮微球的体外释放曲线:选用动情周期规则大鼠,单次皮下注射诺美孕酮微球,阴道涂片,观察诺美孕酮对SD大鼠性周期的影响,确定诺美孕酮微球是否具有长效作用。2.利用ICR小鼠,以皮下注射法建立一种新的皮下子宫内膜异位症模型,并做组织学观察和评价。3.①考察诺美孕酮微球对子宫内膜异位症（EMs）大鼠的药效作用:外科移植法建立大鼠EMs模型,三周后剖腹,模型成功者随机分为五组,分别为模型对照组,R2323（1mg/kg.14d）组,诺美孕酮微球0.5mg/kg.d、2.0mg/kg.d和4.0mg/kg.d组。给药3周后解剖,测量异位内膜体积,了解诺美孕酮微球对大鼠异位内膜体积的影响,解剖时,腹主动脉取血,磁分离酶联免疫测定法测量大鼠血清雌二醇（E2）、孕酮（P）水平;记录子宫卵巢重量,计算脏器系数;子宫组织切片,HE染色,测量子宫内膜上皮高度。②考察诺美孕酮微球对EMs小鼠的药效作用:皮下注射法建立小鼠EMs模型,成功者随机分为七组,分别为正常组、模型对照组,亮丙瑞林（0.02mg/kg.d）组,诺美孕酮微球3、6、12和24.0mg/kg.d组,给药后3周后解剖,测量异位内膜体积,了解诺美孕酮微球对大鼠异位内膜体积的影响;解剖时,腹主动脉取血,ELISA法测度小鼠血清促卵泡激素（FSH）和促黄体激素（LH）水平;记录子宫、卵巢重量,计算脏器系数;子宫组织切片,HE染色,测量子宫内膜上皮高度。4.①解剖同时,取出小鼠子宫、异位内膜、脑和垂体,固定、切片,免疫组化ABC法测定各组动物子宫及移植异位内膜的雌激素受体（ERα）和孕激素受体（PR）的表达、下丘脑ERα、ERβ和PR的表达、下丘脑弓状核和垂体Kiss-1及其受体GPR54的表达,考察诺美孕酮对小鼠ER、PR、Kiss-1和GPR54表达的影响。②利用大鼠腺垂体组织,采用胰酶消化,体外培养大鼠原代垂体细胞,培养72小时后,加入不同浓度诺美孕酮培养49小时,分别采用GnRH、蛋白激酶C激活剂（PMA）和高浓度钾离子激发垂体细胞的促卵泡素（FSH）和促黄体素（LH）的分泌1小时,考察蛋白激酶C和电压依赖性钙离子通道,在诺美孕酮对垂体细胞分泌FSH和LH的影响中的作用。③解剖同时,迅速取出小鼠脑组织,保存于-70℃液氮,采用Biospring信号转导抗体芯片,比较模型组小鼠和诺美孕酮12mg/kg.d剂量组小鼠下丘脑蛋白表达差异,考察诺美孕酮对下丘脑信号转导通路抗体芯片中蛋白表达的影响。结果:1.体外释放试验显示,在体外,一个月的微球经28天可累积释放约85.1%,每天释放约3.04%:三个月的微球经91天可累积释放约96.5%,每天释放约1.06%。SD大鼠单次皮下注射诺美孕酮微球20070109A或20070109B（80mg/kg.3m）后,动情间期维持时间分别为77.00±1.26天和79.67±4.13天,动情间期延长。2.小鼠造模成功率为83.33%,异位灶主要位于皮下肌层,少数位于游离的皮下黏膜,呈透明的囊状,囊内有清亮的液体积聚;镜下可见囊内壁有内膜上皮细胞生长。3.①大鼠模型造模成功率为86.9%,诺美孕酮2和4mg/kg.d能显著降低异位内膜体积,抑制率显著高于模型组;诺美孕酮0.5、2和4mg/kg.d能显著降低子宫和卵巢脏器系数;诺美孕酮0.5和2mg/kg.d能显著降低子宫内膜上皮层高度;诺美孕酮0.5和2mg/kg.d能显著降低血清E2水平;对血清P水平无影响。②小鼠模型造模成功率为82.5%,诺美孕酮6、12和24mg/kg.d能显著降低异位内膜体积,抑制率显著高于模型组;诺美孕酮3、6、12和24mg/kg.d能显著降低卵巢脏器系数,对子宫脏器系数无影响;诺美孕酮对小鼠子宫内膜上皮层高度无影响:诺美孕酮6和12mg/kg.d能显著降低血清FSH和LH水平。4.①异位内膜上表达的ERα显著低于子宫内膜,PR无显著差异;诺美孕酮3、6、12和24mg/kg.d能显著降低子宫内膜ERα和PR的表达;诺美孕酮6、12和24mg/kg.d能显著降低下丘脑ERα的表达,6mg/kg.d能显著升高ERβ的表达,诺美孕酮各剂量组均显示ERα/ERβ比值显著下降;诺美孕酮6、12和24mg/kg.d能显著降低下丘脑PR的表达。诺美孕酮3、6、12和24mg/kg.d能显著降低下丘脑ARC区Kiss-1和GPR54的表达;诺美孕酮3、6和12mg/kg.d能显著降低腺垂体Kiss-1和GPR54的表达,24mg/kg.d仅显著下调腺垂体Kiss-1的表达。②与对照组相比,10-5和10-6mol.L-1诺美孕酮能显著抑制GnRH诱导的腺垂体细胞LH释放,10-5、10-5、10-8和10-10mol.L-1诺美孕酮能显著抑制GnRH诱导的FSH释放;10-5、10-6、10-8和1010mol.L-1诺美孕酮能显著抑制PMA诱导的LH释放,10-5、10-6和10-10mol.L-1诺美孕酮能显著抑制PMA诱导的FSH释放:10-5、10-6和10-8mol.L-1诺美孕酮能显著抑制高钾离子诱导的LH释放,10-5和10-6mol.L-1诺美孕酮能显著抑制高钾离子诱导的FSH释放。③下丘脑的Biospring信号转导抗体芯片结果显示,与模型对照组相比,在164个测定的目标蛋白中,诺美孕酮使48个蛋白表达发生差异,其中显著上调蛋白仅有2个:抗肌萎缩蛋白和碱性磷酸酶（AP）;而诺美孕酮显著下调蛋白质有46个:主要包括（1）激素相关通路、（2）细胞因子相关通路（3）血管发生相关通路、（4）致癌基因相关通路、（5）细胞凋亡相关通路、（6）其他:细胞周期、神经细胞相关、腺病毒相关、肿瘤标记物及个别蛋白。结论:诺美孕酮微球体内外释放稳定,具有长效缓释作用。ICR小鼠皮下子宫内膜异位症模型,简单易行,稳定可靠,为成功的Ems新动物模型。诺美孕酮微球通过抑制血清E2、FSH和LH水平,降低实验动物的子宫和卵巢脏器系数,降低子宫内膜层高度,抑制异位内膜的生长,发挥对EMs大鼠和小鼠模型的治疗作用。首次发现,诺美孕酮能选择性降低子宫的ERα和PR的表达;诺美孕酮能作用于HPOA轴的上位,在下丘脑,诺美孕酮选择性降低ERα和PR的表达,一定程度上促进ERβ的表达,诺美孕酮对子宫和下丘脑ERα、ERβ和PR的选择性调节作用,与诺美孕酮治疗子宫内膜异位症的作用机制有关。本研究首次发现,与正常组相比,模型组小鼠下丘脑ARC区Kiss-1和GPR54表达显著升高,而模型组小鼠Kiss-1/GPR54的过度表达,可能与EMs的发病机制相关。诺美孕酮作用于ARC发挥激素负反馈作用,反馈性下调ARC区Kiss-1和GPR54的表达。诺美孕酮对Kiss-1-GPR54-GnRH-GnRH受体-促性腺激素分泌级联通路的抑制作用,与诺美孕酮治疗子宫内膜异位症的作用机制有关。首次发现,诺美孕酮不仅下调Kiss-1/GPR54在腺垂体的表达,还抑制GnRH诱导的垂体细胞FSH和LH的分泌,这种抑制作用与GnRH信号通路上的蛋白激酶C和电压依赖性钙离子通道有关。抗体芯片发现,诺美孕酮对GnRH通路上的Raf-1表达也有抑制作用,进一步说明诺美孕酮对GnRH信号通路上多个元件的调节作用,与诺美孕酮治疗子宫内膜异位症的作用机制有关。芯片结果验证,诺美孕酮的作用虽与垂体PKC有关,但与下丘脑PKC无关;FSH-b的下调与诺美孕酮对FSH的下调相关。诺美孕酮治疗子宫内膜异位症的作用机制与雄激素受体无关,而与孕酮受体相关。芯片结果首次发现:①诺美孕酮通过抑制IL-6、HGF和NF kappaB等一系列细胞因子相关蛋白的表达,调控细胞因子相关通路;②诺美孕酮通过对血管发生相关蛋白表达的抑制,调控血管发生相关通路;③在下丘脑,诺美孕酮显著下调相关致癌基因的蛋白表达,调控致癌相关基因的蛋白表达相关通路;④诺美孕酮对下丘脑神经元细胞的凋亡通路主要是促进作用,也有一定的抑制作用,诺美孕酮对下丘脑神经元的细胞凋亡的具有双向调节作用,以上发现均与诺美孕酮治疗子宫内膜异位症的作用机制有关。此外,诺美孕酮治疗子宫内膜异位症的作用机制,还可能与细胞周期相关蛋白、神经细胞相关蛋白、肿瘤标记物等有关。
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