龙须菜世代差异表达基因和泛素基因的克隆及功能分析

论文摘要

龙须菜已经成为我国继海带和紫菜后的第三大栽培海藻,不仅是江蓠属的一个重要的产琼胶物种,而且还是一种遗传学研究的好材料。因此,对龙须菜进行基础研究,具有重要意义。本论文构建了龙须菜四分孢子体和雌配子间正反向抑制性消减杂交（SSH）文库,分离了两世代间差异表达的基因,并对其中若干基因进行了功能研究。本研究选取正反向SSH文库中各384个克隆进行斑点杂交筛选,筛选出14个在两世代间差异表达的基因,序列测定后提交到NCBI网站上GenBank数据库,序列登录号为DQ008074-87。其中的7条序列分别与编码小GTP结合蛋白（Small GTPase）即小G蛋白、天冬氨酸转移酶、GMP合成酶、硫胺素焦磷酸化酶、R42蛋白和两种未知功能蛋白有同源性,而其余7条序列没有找到与其相匹配的基因。Virtual Northern杂交实验进一步证实了14个基因中的11个在两世代间呈现表达差异,其中7个是四分孢子体中上调表达的基因,3个在雌配子体中上调表达以及1个四分孢子体特异表达的基因。论文中选择了SSH文库中在雌配子体中上调表达的小G蛋白基因和一个在四分孢子体中特异表达的基因,进行cDNA全长序列的分离及功能分析。序列比对后发现,该龙须菜小G蛋白尤其与动物来源的Rab11有较高的同源性。在小G蛋白基因的RACE反应中,PCR扩增出两种小G蛋白基因转录物。测序后将二者与其基因组序列比较后发现,其中一个是mRNA前体加工过程中的中间体,另一个是成熟的mRNA,前者只剪切掉了一个内含子,而在成熟mRNA分子中两个内含子均被剪切掉了。Rab基因的两种转录物序列及其在基因组上的序列均提交到NCBI网站,GenBank序列登录号分别为DQ062156、AY904354和DQ019225。Southern杂交结果表明该基因在龙须菜基因组中可能是单拷贝的。我们还利用两种原核表达载体（融合表达载体pGEX和非融合表达载体pBV220）,在大肠杆菌中表达了龙须菜小G蛋白,对融合重组表达产物进行了抗原性及其抗血清的免疫特异性分析。结果表明该重组蛋白具有很强的免疫原性和免疫特异性。利用Western杂交技术对两种表达产物进行体外GTP结合性分析,实验结果表明这两种重组蛋白均具有GTP结合活性。我们还从文库中选取了一个四分孢子体特异表达基因（克隆SSH466）,分离了cDNA全长序列,GenBank序列登录号DQ019223。序列同源性分析表明,该基因是一个未知功

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• 缩 写 表
• 摘 要
• Abstract
• 前言
• 第一章 文献综述
• 第一节 红藻发育生物学研究进展
• 1 红藻发育细胞生物学研究进展
• 2 藻类发育分子生物学研究进展
• 3 藻类功能基因研究进展
• 第二节 抑制性消减杂交原理及其应用
• 1 寻找差异表达基因的方法
• 2 SSH 原理及流程
• 3 SSH 的优缺点及适用范围
• 4 SSH 在植物基因克隆上的应用
• 5 SSH 在藻类基因克隆上的应用
• 第三节 植物小G 蛋白Rab 亚家族研究进展
• 1 小G 蛋白的种类、结构特点及调控过程
• 2 植物小G 蛋白的功能
• 3 藻类小G 蛋白研究进展
• 第四节 植物泛素及其研究进展
• 1 泛素基因特点
• 2 Ub/265 蛋白酶体降解途径
• 3 Ub/265 蛋白酶体途径在植物中的生理功能
• 4 Ub/265 蛋白酶体系统基因进化
• 5 藻类泛素研究进展
• 第五节 立项依据
• 第二章 龙须菜雌配子体与四分孢子体差异表达基因的分离与鉴定
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三章 龙须菜 Rab 基因和克隆SSH466 cDNA 全长序列分离及功能分析
• 第一节 Rab 基因的克隆及功能分析
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二节 克隆SSH466 全长cDNA 序列的分离及分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与讨论
• 第四章 龙须菜泛素基因的克隆、序列分析及表达的初步研究
• 第一节 泛素基因的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与讨论
• 3 讨论
• 第二节 多聚泛素基因上游调控序列的克隆
• 1 材料与方法
• 2 结果与讨论
• 3 讨论
• 第三节 泛素基因世代表达谱的初步研究
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果与讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 文章发表情况