HBcAg重组腺病毒转染人PBMCs对TLR9和IRF7表达的影响

论文摘要

目的：采用腺病毒为载体将HBcAg基因负载正常人和慢性HBV携带者外周血单个核细胞（PBMCs）,检测转染前后TLR9,IRF7表达情况,IFN-a产生水平,以了解慢性HBV感染者免疫识别状态的变化。方法：构建携带HBcAg基因复制缺陷型的重组腺病毒,将其转染正常人和慢性HBV携带者PBMCs,按分组予高拷贝HBV-DNA血清和（或）CpG-ODN2006刺激,RT-PCR方法检测转染前后TLR9,IRF7mRNA表达,Western-Blot方法检测TLR9,IRF7蛋白表达,Elisa方法检测培养液中的IFN-a水平。结果：①RT-PCR结果显示转染前慢性HBV携带组TLR9,IRF7mRNA的表达低于健康正常者（P<0.05）,其中,转染前予CpG-ODN2006刺激后HBV携带者和健康正常者TLR9,IRF7mRNA表达未有显著上升（P>0.05）；转染后予CpG--ODN2006刺激HBV携带者和健康正常者较转染前TLR9,IRF7mRNA表达有显著增强,差异有统计学意义（P<0.05）②与TLR9,IRF7mRNA表达一致,Western-Blot结果显示转染后健康正常者予各刺激后较转染前TLR9,IRF7蛋白表达增强,差异具有统计学意义（P<0.05）,慢性HBV携带者转染后较转染前TLR9,IRF7蛋白表达增强,差异有统计学意义（P<0.05）。③Elisa结果显示转染前后慢性HBV携带组IFN-α产生水平低于健康对照组（P<0.05,P<0.05）,健康正常者及慢性HBV携带者转染后培养上清IFN-a产生水平较转染前明显增强,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：①转染前慢性HBV感染者PBMCs TLR9,IRF7mRNA及蛋白表达,IFN-a产生水平显著低于健康正常者,提示慢性HBV感染者PBMCs识别HBV核酸DNA能力下降,不能有效激活IRF7,不能分泌足量的IFN-α清除病毒造成慢性持续感染可能；②Ad-HBcAg转染慢性HBV携带者PBMCs后IFN-a产生水平低于健康对照组转染后IFN-a产生水平,提示HBV持续感染与PBMCs免疫功能下降有关；③Ad-HBcAg转染PBMCs后TLR9,IRF7mRNA及蛋白的表达及IFN-α的分泌水平较未转染前增强证实了TLR9为胞内受体,予胞内刺激可产生较强的抗HBV免疫；④转染后CpG-ODN可激活慢性HBV携带者PBMCs中TLR9,IRF7的表达,同时增强IFN-α的分泌,提示可通过采用CpG-ODN发挥机体固有免疫抗HBV感染。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 研究对象
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 基因引物序列
• 2.2.5 配体
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 主要溶液的配制
• 2.3.2 细胞培养、病毒扩增及滴度测定
• 2.3.3 Fyonicoll-Hypaque（密度梯度离心法）分离PBMCs
• 2.3.4 实验分组
• 2.3.5 接种细胞
• 2.3.6 转染
• 2.3.7 RT-PCR检测PBMCs TLR9,IRF7 mRNA的表达
• 2.3.8 Western blot技术检测TLR9、IRF7蛋白表达
• 2.3.9 Elisa检测PBMCs IFN-a水平
• 2.4 统计学处理
• 第3章 结果
• 3.1 HEK293T细胞培养及病毒扩增
• 3.2 外周血来源PBMCs的形态观察及转染后绿色荧光表达
• 3.3 RT-PCR检测转染前后TLR9在PBMCs中的表达
• 3.4 Western Blot分析转染前后PBMCs TLR9表达水平
• 3.5 RT-PCR检测转染前后IRF7在PBMCs中的表达
• 3.6 Western Blot分析转染前后PBMCs IRF7表达水平
• 3.7 Elisa检测转染前后PBMCs IFN-a水平
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 参考文献