论文摘要
研究背景:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌（NSCLC）约占全部肺癌的80%,许多患者确诊时就已至晚期。化疗已成为晚期NSCLC的重要治疗手段,但常规化疗的客观有效率仍较低（30%～50%）。靶向治疗作为一种新的抗肿瘤治疗手段,与常规化疗相比既能提高疗效又降低了药物毒性。多肽类受体作为恶性肿瘤诊断和治疗的分子靶点已成为研究的热点,生长抑素受体（somatostat in receptor,SSTR）是其典型代表。非小细胞肺癌患者生长抑素受体放射显像阳性率很高（75%～100%）,这为非小细胞肺癌的生长抑素受体靶向治疗提供了可能。已有研究表明,生长抑素类似物—奥曲肽（OCT）可以偶联紫杉醇（PTX）,偶联物经生长抑素受体的内吞作用进入肿瘤细胞。本实验室已系统研究了人非小细胞肺癌细胞SSTR表达情况,以及奥曲肽-紫杉醇偶联物在体外对非小细胞肺癌细胞株A549、H157、Calu-6等的作用,均显示出明显的生长抑制作用。研究目的:建立A549移植瘤动物模型,检测A549细胞在裸鼠体内SSTR的表达情况,以不同浓度奥曲肽、紫杉醇、奥曲肽-紫杉醇偶联物作用于A549移植瘤动物模型,观察肿瘤的生长和小鼠生存时间,从而探讨奥曲肽-紫杉醇偶联物在体内对人非小细胞肺癌生长抑制作用并初步探讨其作用机制。研究方法:1、药物合成,构建奥曲肽-紫杉醇偶联物（PTX-OCT和2PTX-OCT）;2、动物模型的建立,建立裸鼠腋部皮下移植瘤模型,将荷瘤裸鼠随机分为8组,在1、7、21天尾静脉分别注射150nmol/kg PTX-OCT、2PTX-OCT、OCT与PTX混合物（OP）、OCT、PTX及300nmol/kg PTX和2PTX-OCT;3、观察指标:检测各组小鼠体重及肿瘤体积;计算肿瘤倍增时间;眼内眦静脉取血测每组小鼠白细胞数量;组织切片HE染色及核仁区银染（AgNOR）观察肿瘤细胞生长情况;DNA Ladder法检测细胞凋亡;RT-PCR法测肿瘤细胞生长抑素受体1至5亚型（SSTR1-SSTR5）mRNA表达情况;免疫组化SP法检测肿瘤微血管密度（MVD）以及生长抑素受体2和5亚型（SSTR2,SSTR5）表达情况。研究结果:1、成功合成了奥曲肽—紫杉醇耦联物（PTX-OCT和2PTX-OCT）。PTX-OCT由1分子PTX的中间体2｀-丁二酰紫杉醇（WP-06-1）与1分子OCT制备,PTX可以连在OCT的N-端,也可以连在赖氨酸侧链上,形成了两种产物PTX-Phe-OCT、PTX-Lys-OCT;HPLC两种产物几乎重叠,将经HPLC分离纯化所得宽单峰产物用作实验中的PTX-OCT样品;2PTX-OCT由2分子PTX的中间体2｀-丁二酰紫杉醇（WP-06-1）与1分子OCT制备,并经HPLC分离纯化及质谱分析:MS 2892.8;实际相对分子质量为2890.19(C157H171N12O42S2)。2、常规培养A549细胞,取对数生长期细胞,用6号针头吸取细胞悬液0.2ml（约5×106个）注射入裸鼠右腋背部皮下,隔日观察肿瘤生长情况,成瘤时间约为9天左右,成瘤率100%,用公式V=1/2×长×宽2计算肿瘤体积。3、实验于首次给药后42日结束,实验结束时150nmol/kg与300nmol/kg 2PTX-OCT处理组在3次给药后与对照组相比:肿瘤生长显著抑制（P＜0.01）,肿瘤体积分别小了60.7%及70.3%;肿瘤倍增时间由对照组的9.07±0.61天分别延长到12.35±0.94天和14.16±1.64天（P＜0.01）;PTX与2PTX-OCT处理组相比,在每次给药后5天裸鼠体重减轻有统计学差异（P＜0.05）;PTX组与2PTX组的白细胞总数在18～28天明显降低,第26日两组白细胞数降到最低,分别为7610±780.54个/mm3、6690±611.76个/mm3,与对照组（10133±375.06个/mm3）、2PTX-OCT组（9302±900.37个/mm3）及2（2PTX-OCT）组（8931±717.93个/mm3）相比差异有统计学意义（P＜0.05）。4.组织学结果:2PTX-OCT组及2（2PTX-OCT）组MVD分别为（8.2±1.6）与（6.7±1.2）,较对照组的（18.8±4.0）显著减少（P＜0.01）。DNA ladder法显示2PTX-OCT处理组有明显的DNA片段化的梯状条带。生长抑素受体1,2,4,5亚型（SSTR1,2,4,5）的mRNA在荷瘤小鼠体内表达;免疫组化显示SSTR2主要表达于肿瘤细胞的细胞膜上,SSTR5表达于肿瘤细胞的细胞膜和细胞质中。结论:150nmol/kg与300nmol/kg 2PTX-OCT疗效相当,可显著抑制肿瘤增殖,减少肿瘤微血管形成,显示出良好的治疗作用,有望成为晚期非小细胞肺癌的有效治疗手段之一。
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