逆转录病毒介导果蝇多底物脱氧核苷激酶（Dm-dNK）基因对乳腺癌治疗的试验研究及CD133，PAX2，ESA，和GPR30在浸润性导管乳腺癌中的表达

论文摘要

第一部分逆转录病毒介导果蝇多底物脱氧核苷激酶（Dm-dNK）基因对乳腺癌细胞株的杀伤作用及旁观者效应的观察目的:观察pLXSN-dNK/核苷类似物AraT（Arac）系统基因治疗方案对乳腺癌细胞株的杀伤作用及其中存在的旁观者效应。方法:以含自杀基因的pLXSN-dNK和空质粒pLXSN的重组逆转录病毒分别感染乳腺癌细胞株MCF7和MDA-MB-231细胞,分别设立无病毒感染的MCF7和MDA-MB-231乳腺癌细胞为对照组,加入终浓度为8μg/ml的polybrene辅助病毒感染。感染6小时后更换新鲜培养液,24小时重复感染一次,末次感染后48小时加入含G418的筛选培养基,筛选21天。筛选21天后对抗性细胞克隆进行扩大培养,所获抗性细胞分别命名为MCF7-pLXSN、MCF7-dNK、MDA-MB-231-pLXSN和MDA-MB-231-dNK。设MCF7-dNK/MDA-MB-231-dNK细胞为实验组,MCF7/MDA-MB-231、MCF7-pLXSN/MDA-MB-231-pLXSN细胞为对照组,细胞培养过程中加入AraT或AraC,用MTT法测定AraT或AraC对各组肿瘤细胞杀伤效应并计算细胞生长率。将感染Dm-dNK的肿瘤细胞和未感染Dm-dNK的母细胞按照不同比例混和后加入AraT(浓度为10-1mmol/L)或AraC(终浓度为10-3mmol/L),用MTT法测定AraT或AraC对各组混合肿瘤细胞杀伤效应并计算细胞生长率,从而观察有无旁观者效应。结果:在polybrene的辅助下,病毒上清分别感染MCF7和MDA-MB-231乳腺癌细胞,通过新霉素G418抗性筛选获得MCF7-pLXSN、MCF7-dNK、MDA-MB-231-pLXSN和MDA-MB-231-dNK。随着AraT和AraC剂量的增大,MCF7-dNK和MDA-MB-231-dNK细胞受到的抑制作用越明显,实验组与对照组有显著性差异（P＜0.05）。当AraT的浓度为10-1 mmol/L时,当MCF7-dNK在混合细胞的百分比分别为10%、25%、50%、75%时,如果混合细胞中不存在旁观者效应,混合细胞生长的抑制率应该为7.7%、19.25%、38.5%、57.75%。但实际上我们观察到混合细胞的生长抑制率为26.54%、55.45%、59.66%、64.46%。AraT对MCF7与MCF7-dNK混合细胞作用中,不仅可以杀死感染自杀基因的MCF7-dNK细胞,还杀死了部分未感染自杀基因的MCF7细胞,存在旁观者效应。当MCF7-dNK百分比为25%时,旁观者效应效率最大。AraT对MDA-MB-231与MDA-MB-231-dNK混合细胞作用中,不仅可以杀死感染自杀基因的MDA-MB-231-dNK细胞,还杀死了部分未感染自杀基因的MDA-MB-231K细胞,存在旁观者效应。当MDA-MB-231-dNK在混合细胞中的百分比为10%时,旁观者效应效率最大。AraC对MCF7与MCF7-dNK混合细胞作用中,不仅可以杀死感染自杀基因的MCF7-dNK细胞,还杀死了部分未感染自杀基因的MCF7细胞,存在旁观者效应。当MCF7-dNK在混合细胞中的百分比为25%时,旁观者效应效率最大。AraC对MDA-MB-231与MDA-MB-231-dNK混合细胞作用中,不仅可以杀死感染自杀基因的MDA-MB-231-dNK细胞,还杀死了部分未感染自杀基因的MDA-MB-231细胞,存在旁观者效应。当MDA-MB-231-dNK在混合细胞中的百分比为10%时,旁观者效应效率最大。结论:在体外试验中,感染自杀基因Dm-dNK乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231对核苷类似物的敏感性明显增强;pLXSN-dNK/AraT（AraC）自杀基因/前药系统在乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中存在旁观者效应。第二部分自杀基因/前药系统Dm-dNK/AraC对裸鼠接种MDA-MB-231肿瘤的治疗作用目的:观察Dm-dNK/AraC自杀基因/前药系统对裸鼠乳腺移植瘤的治疗效果。方法:选取周龄为5-6周的雌性裸鼠18只,在裸鼠的右腋下皮下注射MDA-MB-231细胞悬液,待肿瘤生长至直径约为3mm时（约7天）,随机分成3组,每组按照注射病毒也的不同分别命名为A组（对照组:pLXSN）,B组（空白对照组,不注射病毒液）,C组（治疗组:pLXSN-dNK）,瘤内多点注射50ul病毒液（含8 ug/ml的polybrene）或什么都不注射予荷瘤鼠,每日一次,连续3天,同时腹腔注射AraC（3 mg/kg）每日一次连14天后观察肿瘤生长情况。每天观察裸鼠状态,隔日记录各组裸鼠肿瘤大小（长短径）,计算体积（Z=3.14ab2/6,a为长径,b为短径）。制作肿瘤生长曲线图,并观察记录各组裸鼠生存期。结果:乳腺癌细胞MDA-MB-231皮下注射接种肿瘤至裸鼠右腋下建立荷瘤动物模型,各组瘤内注射病毒后,腹腔注射前药AraC,治疗组与对照组相比,治疗组瘤体生长速度明显缓慢,肿瘤体积明显小于对照组（p＜0.05）。治疗组的裸鼠存活时间较长。结论:Dm-dNK/AraC自杀基因/前药系统基因治疗方案对裸鼠皮下乳腺肿瘤有明显的杀伤和抑制作用,延长了荷瘤鼠的存活时间。第三部分CD133,PAX2,ESA,and GPR30在浸润性导管乳腺癌中的表达目的:乳腺癌的生化标志物提供了大量的信息,并帮助制定最佳的治疗方案。我们检测了在浸润性导管乳腺癌中,癌干细胞样标志物（CD133、PAX2、ESA）和膜雌激素受体（GPR30）与临床病理参数、肿瘤复发和某些生化标志物的表达之间的相关性。方法:在74个浸润性导管乳腺癌中,我们用免疫组化方法检测而来这些生化标志物的表达情况,以及他们与已知的临床病理参数、肿瘤复发和某些生化标志物间的相关性。我研究了这些生化标志物之间的相关性。结果:一个公认的癌干细胞标志物CD133与肿瘤大小、肿瘤分期和淋巴结转移正相关。PAX2与肿瘤复发负相关。一个乳腺癌干细胞标志物ESA是一个肿瘤复发的标志物。GPR30与激素受体相关。尽管GPR30与核雌激素受体之间的相关性,他们之间的表达是相互独立的。GPR30的表达与C-erbB2高表达明显相关,是相关肿瘤复发。GPR30与CD133之间存在正相关。结论:在乳腺浸润性导管癌中,CD133、PAX2、ESA和GPR30的检测有助于更精确的预测乳腺癌的浸润特性,帮助最佳治疗方案的制定。

论文目录

• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 英文缩略语
• 论文 逆转录病毒介导果蝇多底物脱氧核苷激酶（Dm-dNK）基因对乳腺癌治疗的试验研究
• 前言
• 论文一 逆转录病毒介导果蝇多底物脱氧核苷激酶（Dm-dNK）基因在体外对乳腺癌细胞株的杀伤作用及旁观者效应的观察
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 论文二 自杀基因/前药系统Dm-dNK/AraC对裸鼠接种MDA-MB-231肿瘤的治疗作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 论文三 CD133,PAX2,EGA,和GPR30在浸润性导管乳腺癌中的表达
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 本研究创新性的自我评价
• 综述
• 个人简历