论文摘要
目的外伤、肿瘤及先天性疾病造成的气管缺损在临床上较为常见。在缺损较短时，可直接行端端吻合修复，而一旦环状缺损超过5个环或3cm，端端吻合就明显较为困难。此时，寻找气管替代物进行气管重建是最为理想的治疗手段。自19世纪末气管外科发展以来，气管重建替代物的研究主要集中在人工气管、自体组织、同种异体气管及组织工程化气管上，其中组织工程化气管因其在免疫排斥、材料来源等方面的优势逐渐成为气管重建外科的研究热点。组织工程化气管即为将经体外扩增的种子细胞接种在具有环样结构的支架材料上，通过细胞之间相互黏附、生长繁殖、分泌细胞外基质，形成一定形状且具有一定功能的气管环，原位移植从而达到修复缺损、重建功能的目的。本研究的目的是使用化学消化法脱除同种异体气管环组织内细胞成分，形成气管组织脱细胞基质。同时采用自体骨髓MSCs体外诱导向软骨细胞分化作为种子细胞，与同种异体气管脱细胞基质共同培养，观察诱导的MSCs在脱细胞基质上的黏附、生长和增殖情况，以期寻找到组织工程化气管构建理想的种子细胞和生物支架材料。方法1、取4月龄Beagle犬6只，行双侧胫骨结节平台穿刺抽取骨髓14～16ml，以1.073g／ml密度Percoll分离液结合贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs），体外培养传代。取第3代细胞在含15％FBS的L-DMEM培养基内加入TGF-β1浓度为10ng／ml、IGF-Ⅰ为10ng／ml，维生素C为37.5μg／ml，转铁蛋白6.25μg／ml进行成软骨细胞定向诱导，对照组未添加任何细胞因子。通过相差显微镜每日观察细胞生长和形态变化情况；MTT法监测细胞生长情况变化并绘制生长曲线；阿尔新兰法检测细胞培养液内GAG含量变化；细胞单层爬片作甲苯胺蓝、Masson三色染色和Ⅱ型胶原免疫组化等组织学方法观察诱导细胞软骨细胞基质分泌和Ⅱ型胶原生成情况。观察骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的情况。2、另取4～6月龄当地健康杂种犬，处死后立即手术切取甲状软骨下第6～10环气管段，以无菌PBS冲洗后，顺序浸入1％Triton X-100和DNAse、RNAse溶液内振荡消化。其中以1％Trixton消化时间长短分为24小时组、48小时组、72小时组和120小时组。分别采用组织切片HE染色、扫描电镜等方法观察样本脱细胞效果并比较。3、收集诱导第7天骨髓MSCs，调整细胞浓度为3×106／ml，与经处理的同种异体气管脱细胞基质体外复合培养，于第3、7、14天取复合物行电镜观察MSCs在脱细胞基质表面黏附生长情况。取体外培养第7天复合物与单纯脱细胞基质及新鲜同种异体气管环样本分别埋植宿主犬皮下，分别于第14天和第30天取出埋植物行组织切片MSCs在脱细胞基质内的生长情况，观察软骨基质内有无细胞成分生成。结果1、倒置相差显微镜下观察初接种时原代MSCs24小时开始逐渐贴壁，72小时贴壁细胞明显增多，5天左右形成分布均匀的细胞集落，7～8天集落逐渐增大，相邻集落融合成片状。10天左右原代细胞铺展面积可达到80％以上。传代细胞融合速度明显加快，细胞变大，MTT生长曲线显示P1代次细胞生长能力最为旺盛，至P3代细胞生长情况逐渐稳定。2、加入诱导因子后细胞逐渐变圆变大，增殖速度加快。MTT检测显示P3细胞诱导组生长曲线较未诱导组明显左移。诱导14天细胞培养液内GAG含量（42.48±2.32）μg／ml较同代次未诱导组（19.62±1.30）μg／ml升高（p＜0.01）。诱导第14天细胞甲苯胺蓝染色见胞浆内广泛蓝染，Masson三色染色见胞浆绿染，Ⅱ型胶原免疫组化染色见胞浆内黄色或棕黄色颗粒出现，而未诱导组阳性细胞不明显。3、使用1％Triton X-100溶液与酶联合消化法制备犬同种异体气管脱细胞基质至少需要作用120小时，方可完全脱除气管黏膜及软骨部分全部细胞成分。HE染色显示120小时组气管样本细胞成分完全脱失，黏膜脱细胞基质局部与软骨基质分离，软骨基质完整无明显破坏；扫描电镜显示气管脱细胞基质黏膜细胞及软骨细胞脱除彻底，去除黏膜部分可见软骨基质表面软骨陷窝结构清晰，陷窝内无细胞结构。4、诱导MSCs与异体气管脱细胞基质体外联合培养3天电镜下即可见细胞定植于基质表面，有伪足伸出。7天时可见数层细胞生长于基质表面，细胞之间互相连接成片状，并有大量细胞外基质分泌，呈“冰霜”样改变。14天时可见基质表面细胞出现凋亡，部分细胞呈空泡样改变。复合物宿主犬皮下埋植14天HE染色基质表面可见多层细胞，细胞呈扁长形，胞核较大。软骨脱细胞基质内部未见细胞长入。周围有肉芽组织包裹，可见少量淋巴细胞浸润。30天时软骨基质浅层可见少量细胞成分长入，但无明显新生软骨形成。大部分软骨胶原基质被破坏分解，可见较多淋巴细胞浸润。结论1、骨髓间充质干细胞是软骨组织工程理想的种子细胞。取材方便，Percoll分离液分离结合贴壁纯化可以获取大量骨髓间充质干细胞，体外培养性能稳定，易于传代扩增，在一定诱导条件的培养下，可以分化为软骨细胞。2、去污剂-核酸酶联合消化法使用1％Triton X-100可有效去除气管样本全部细胞成分，对细胞外基质无明显破坏，可保持气管脱细胞基质结构完整性。3、诱导后MSCs可在脱细胞气管基质表面黏附增殖良好，并分泌大量细胞外基质。但经体外培养与皮下埋植MSCs无法长入脱细胞基质内部，说明同种异体脱细胞基质作为组织工程化气管支架材料，虽然具有良好的细胞相容性，但是其孔隙率和贯通性有待进一步改进。
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标签：骨髓间充质干细胞论文; 细胞外基质论文; 气管论文; 组织工程论文; 同种异体论文;