基于固定化AChE化学发光生物传感器在农药残留检测中的研究

论文摘要

有机磷和氨基甲酸酯类农药以其高效的杀虫能力而非常广泛的应用于农业中。然而,正是由于它的广泛使用,有机磷和氨基甲酸酯类农药残留带来了严重的环境污染,这也对人类健康的造成了很大的威胁。目前实际应用的一些检测方法,如：液相色谱、气相色谱、质谱或者这些方法的联用,虽然这些方法测定结果准确、可靠,但它们需要专业的操作人员和昂贵的设备,因此,难以满足现场快速检测的需要。相对而言,酶生物传感器为有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测提供一条快速、简便的途径。本研究将淡水鲫鱼肌肉乙酰胆碱酯酶（AChE）作为生物传感器的敏感元件,化学发光仪作为检测器,并以鲁米诺-铁氰化钾体系为化学发光体系,通过流动分析法来检测有机磷和氨基甲酸酯类农药。研究结果和内容如下：1、以淡水鲫鱼脑和肌肉中AChE为酶源,以辛硫磷、乐果、敌敌畏、毒死蜱、丁硫克百威、克百威为抑制剂,分析这几种农药的浓度和抑制时间对鲫鱼脑和肌肉中AChE的活性影响,再计算出半数抑制浓度IC50。结果表明：这几种农药对鲫鱼脑和肌肉粗酶的活性均有较强的抑制效果,且都具有良好的剂量-效应关系,其中丁硫克百威、克百威和敌敌畏对AChE的抑制效果最强。农药对鲫鱼脑和肌肉抑制率达到最大值所需时间分别为10 min和12 min。因此,二者对各类农药的敏感性无显著差异,但考虑到肌肉中AChE原料来源广,所以在以后的研究中将选择小鲫鱼肌肉AChE作为生物传感器的酶源。2、采用聚乙二醇分级沉淀结合硫酸铵盐析法纯化鲫鱼肌肉AChE,并研究了固定化AChE的条件和固定化酶的性质。结果表明：纯化后的AChE比酶活为2329.95μmol/min/g,酶活回收率为48.36%,其纯化倍数为41.37倍。固定化酶的方法为：0.1gCNBr活化的Sepharose 4B凝胶用1 mmol/L的HCl溶胀20 min后,与活力为7U的AChE溶液混合,于4℃下110 g振荡10h。所制备的固定化酶活力回收率为75%,对pH值和温度变化的适应能力均优于非固定化酶,并且固定化方法对酶结构的改变很小3、研究了用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药的化学发光生物传感器。此传感器采用流动分析法,并以鲁米诺-铁氰化钾体系为化学发光体系,农药的浓度是通过检测酶解产物硫代胆碱的量来反映的。抑制的酶可以通过1 mM2-PAM来进行复活,为了提高传感器的灵敏度和缩短分析时间,本研究优化了传感器的参数,具体包括：铁氰化钾和鲁米诺浓度、pH值、流速、农药抑制时间和酶复活时间。在最优的测定条件下,敌敌畏、毒死蜱、丁硫克百威的检出限分别为0.070 mg/kg、0.009 mg/kg、.068 mg/kg。为了进一步验证传感器的实用性,特将传感器应用于检测湖水、苹果和包菜的农药残留,结果说明其具有较高的回收率（75%-105%）和较好的重现性（RSD<10%,n=7）。酶反应器在保存2个月后其相对化学发光值仅下降24.63%。此外,对于传感器的检测原理也做了一定的探讨。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1 农药的使用现状及危害
• 2 有机磷与氨基甲酸酯类农药的使用情况和危害分析
• 3 有机磷与氨基甲酸酯类农药残留的检测现状
• 4 农药残留快速检测方法
• 4.1 化学快速检测技术
• 4.2 酶抑制法
• 4.3 免疫分析法
• 4.4 生物传感器法
• 4.4.1 生物传感器概念和基本结构
• 4.4.2 电化学生物传感器
• 4.4.3 光学生物传感器
• 4.4.4 化学发光生物传感器的发展前景
• 5 本课题研究的内容、目的及意义
• 5.1 研究目标
• 5.2 研究内容
• 5.2.1 敏感性研究
• 5.2.2 固定化鲫鱼脑AChE及其部分性质的测定
• 5.2.3 化学发光生物传感器的研制及其检测效果的评价
• 5.2.4 检测机理的探讨
• 5.3 研究意义
• 第二章 鲫鱼乙酰胆碱酯酶的提取和性质研究
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 粗酶的提取
• 1.3.2 蛋白质含量测定
• 1.3.3 酶活测定
• 1.3.4 不同生长期鲫鱼酶活的测定
• 1.3.5 半抑制浓度测定
• 1.3.6 时间-抑制率曲线
• 2 结果与分析
• 2.1 不同生长期鲫鱼酶活的对比
• 2.2 不同种类农药对AChE粗酶液的抑制效应
• 2.3 不同种类农药对AChE粗酶液的半数抑制浓度
• 2.4 时间-抑制率曲线
• 3 结论与讨论
• 第三章 鲫鱼肌肉乙酰胆碱酯酶的纯化及其固定化
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器设备
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 鲫鱼肌肉AChE的提取
• 1.3.2 PEG分级沉淀鲫鱼肌肉AChE
• 1.3.3 硫酸铵盐析法纯化鲫鱼肌肉AChE
• 1.3.4 固定化酶的制备
• 1.3.5 游离酶和固定化酶的pH稳定性和热稳定性
• 1.3.6 游离酶酶和固定化酶的动力学曲线
• 1.3.7 游离酶的酶活测定和蛋白质测定
• 1.3.8 固定化酶酶活测定
• 1.3.9 PEG含量测定
• 1.3.10 催化动力学分析
• 2 结果与分析
• 2.1 鲫鱼肌肉AChE纯化结果
• 2.1.1 PEG分级沉淀鲫鱼肌肉AChE
• 2.1.2 硫酸铵盐析法沉淀鲫鱼肌肉AChE
• 2.2 固定化条件
• 2.3 固定化酶的pH值稳定性和热稳定性
• 2.4 游离酶和固定化酶的动力学曲线
• 2.5 催化动力学分析
• 3 结论与讨论
• 第四章 基于固定化乙酰胆碱酯酶的化学发光生物传感器的研制
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 主要试剂的配制
• 1.5 实验方法
• 1.5.1 酶反应器的制备
• 1.5.2 传感器的组装及使用步骤
• 1.5.3 传感器的使用步骤
• 1.5.4 农药浓度的测定
• 1.5.5 样品准备
• 1.5.6 农药的氧化
• 2 结果与分析
• 2.1 传感器操作条件
• 2.1.1 铁氰化钾浓度
• 2.1.2 鲁米诺浓度
• 2.1.3 体系pH
• 2.1.4 流速
• 2.1.5 预氧化对农药测定的影响
• 2.1.6 农药抑制时间
• 2.1.7 复活剂恢复酶活时间
• 2.1.8 底物与酶反应时间
• 2.2 标准曲线的建立
• 2.3 检测方法的评价
• 2.3.1 精密度实验
• 2.3.2 回收率实验
• 2.3.3 重复使用效果
• 2.4 固定化酶的保存时间
• 2.5 机理的讨论
• 2.5.1 化学发光分析
• 2.5.2 紫外光谱分析
• 3 结论与讨论
• 3.1 酶传感器条件的优化与性能评价
• 3.3 固定化酶的复活
• 3.4 有机磷农药的预氧化
• 3.5 传感器的机理
• 3.6 进一步的研究方向
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间成果目录