肝病关联基因IL-10/ESR1 rSNP的鉴定及其在HBV相关肝病中的功能研究

论文摘要

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是世界范围内主要的感染病之一,其疾病表型多种多样,从无症状携带、急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎到肝衰竭、肝硬化、肝细胞癌,形成了复杂的疾病谱。HBV感染相关肝病的发生和发展是环境,病毒和宿主相互作用的结果。宿主因素,尤其是宿主基因,影响HBV感染和疾病进程的许多阶段。分离分析和双生子研究提示宿主遗传因素对HBV感染相关肝病疾病表型起着关键的作用。随着人类基因组计划的完成,有关个体遗传变异与疾病的关系日益受到重视,单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）是人类基因组中遗传学变异最常见的一种类型,也是决定不同个体临床表型多样性的重要因素。因此探讨HBV感染相关肝病的宿主遗传易感性,将为我们从另一角度认识HBV感染及发病机制提供新的线索,并为临床防治提供新的、合理的策略。以生物学功能相关基因作为候选基因进行病例-对照关联研究,是当前对复杂疾病进行遗传易感性研究的重要策略。本课题组前期在中国人群15个HBV易感侯选基因的启动子区和外显子区进行了SNP的测序发掘。经病例对照研究、核心家系传递不平衡测试,已确定雌激素受体α（estrogen receptorα,ESR1）、干扰素-γ诱导的10KD蛋白分子（IP-10,CXCL10）和白介素10（interleukin 10,IL-10）等多个基因与HBV感染及其疾病进程相关。但既往研究多集中在侯选基因关联SNP的发掘和HBV感染的关联研究上,对阳性关联位点与其他HBV感染相关肝病的关联研究还未见报道,对侯选基因的功能性SNP的鉴定也还不够深入。进一步研究肝病关联基因IL-10 / ESR1基因多态性与其他HBV相关肝病（HBV相关急性肝衰竭和/或肝硬化）的易感性之间的关系以及鉴定对疾病发生发展起直接作用的调节性多态性位点,将有助于我们全面理解IL-10 / ESR1基因多态性在HBV感染慢性化和重症化机制中的作用。因此,我们选择IL-10和ESR1两个基因为候选基因,拟在中国人群中分析其基因多态性尤其是非编码区（启动子和内含子区）基因多态性与HBV感染相关肝病的关系,并对阳性关联SNP位点的生物学功能意义进行功能验证,从遗传学角度探讨基因多态性与HBV感染相关肝病的易感性及发病机制的关系。本研究拟收集本研究所需的病例对照研究的临床资料和DNA样本,综合采用限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）、扩增折射变异PCR （ ARMS-PCR ）和直接测序法在我们收集的基于医院的病例（如HBV相关急性肝衰竭,HBV相关型肝硬化）-对照（如健康献血员,HBV感染无症状携带者）人群中对选择的IL-10基因启动子区3个SNPs （A-1082G, T-819C和A-592C）位点以及ESR1基因与阳性关联位点T29C连锁的3个SNPs （IVS1 T-401/C, T29C和A252966G）位点进行基因分型、连锁不平衡检测、单倍型分析和关联研究。然后综合采用荧光素酶报告基因试验（DLRA）、电泳移动漂移分析（EMSA）、单倍型等位特异性染色质免疫沉淀技术（HaploChIP）、位点特异性小RNA干扰（SiRNA）等手段对阳性关联的标签SNPs（IL-10 A-592C和ESR1 IVS1 T-401C位点）进行功能验证。我们的主要研究结果如下:1.新收集了1 000余份HBV感染患者的病例资料和血样,完成了所有样本（5000余例）的整理和疾病表型的归类。2.我们在345名HBV相关急性肝衰竭患者,367例HBV感染无症状携带者和414名健康献血员正常对照中成功进行了IL-10基因启动子区3个SNPs位点（A-1082G, T-819C和A-592C）分型,结果发现HBV相关急性肝衰竭患者病例组中-592C和-819C的等位频率显著高于HBV感染无症状携带者疾病对照组和健康献血员正常对照组（P = 6.9×10-7）。经非条件logistic回归校正年龄、性别、饮酒指数等因素后,在显性模式下,IL-10 A-592C和T-819C两个SNP位点与HBV相关急性肝衰竭显著关联。和-592A/C或A/A基因型个体相比,C/C基因型的个体对HBV相关急性肝衰竭易感性显著升高（显性模式:OR=2.07, 95% CI 1.47-2.92, P= 0.0000）。3.我们在359名HBV感染相关急性肝衰竭患者,469名HBV感染相关肝硬化患者和468例HBV感染无症状携带者对照中进行ESR1基因3个SNPs位点（IVS1 T-401C, T29C, A252966G）的分型,结果发现HBV相关急性肝衰竭患者病例组和HBV相关肝硬化患者病例组中IVS1 -401C和29C的等位频率显著高于HBV感染无症状携带者疾病对照组。经非条件logistic回归校正年龄、性别等因素后, IVS1 T-401C和T29C两个SNP位点与HBV相关急性肝衰竭（分别为P =0.0246, P =0.0071）以及HBV相关肝硬化（分别为P=3.0×10-4, P=5.4×10-6）的易感性显著关联。ESR1基因单倍型29C -401C增加了HBV相关急性肝衰竭（显性模式: P=0.0116, OR =1.46, 95% CI 1.08-1.96）以及HBV相关肝硬化（显性模式:P = 0.0000, OR =1.83, 95% CI 1.38-2.44）易感性。4.体外EMSA实验证实HBV感染相关急性肝衰竭相关联的IL-10启动子区A-592C位点存在核蛋白结合位点,且两种等位的结合能力存在差异。活体状态下的ChIP实验证实A-592C位点两种等位都能与RNA多聚酶Ⅱ特异性结合,但两种等位的结合量表现为等位特异性差异,C等位的RNA多聚酶Ⅱ特异性结合量大于A等位,说明IL-10基因启动子-592C等位对IL-10表达的调控能力强于A等位。IL-10基因表达分析表明,携带有-592C等位的个体PBMC中IL-10 mRNA的表达和细胞因子水平也比不携带有有-592C等位的个体强。说明IL-10 A-592C两个等位对IL-10的表达调控能力存在差异,C等位强于A等位。IL-10 A-592C位点是一个功能性调节性SNP,-592C等位通过上调IL-10基因的表达而增加了HBV相关肝衰竭发病的危险因素。5.采用荧光素酶报告基因试验、EMSA、HaploChIP、位点特异性RNA干扰等手段,多个角度首次证实了ESR1外显子1 T29C位点连锁的内含子1 IVS1 T-401C位点的等位特异性顺式调控作用,IVS1 T-401C位点两个等位通过对核蛋白C-myb的结合能力的差异从而影响了ESR1的表达（mRNA和蛋白水平）,-401C等位对核蛋白C-myb的结合能力更强,表现出更强的增强子活性,可能通过影响了ESR1表达量而增加了HBV相关肝衰竭和肝硬化发病的危险因素。总之,我们通过大样本的病例对照研究在群体水平和流行病学角度首度证实了IL-10和ESR1基因多态性与HBV感染相关肝病（ALF和LC）的关联,并通过系列功能研究证实阳性关联位点IL-10启动子区A-592C和ESR1 IVS1 T-401C位点为功能性调节性SNP（regulatory SNP, rSNP）,其与疾病的关联并不单纯是一种标志的间接关联,而是通过影响了基因的表达而增加了HBV相关肝衰竭和肝硬化发病危险因素的直接关联。我们的研究从另一角度提示雌激素信号通路和Th2细胞因子信号通路在HBV感染及其疾病进程中发挥重要作用,为HBV感染及发病机制的基础研究提供新的线索,并为临床医生针对HBV感染相关肝病的个性化防治策略提供新的思路。

论文目录

• 主要英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 肝病关联基因IL-10/ESR1 rSNP 的鉴定及其在HBV 相关肝病中的功能研究
• 前言
• 第一部分 HBV相关肝病病例对照样本的收集
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 IL-10 / ESR1 基因多态性与HBV 相关肝病的遗传关联研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 IL-10 -592A/C 关联位点的功能研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 ESR1 IVS1 -401T/C 关联位点的功能研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 HBV 相关肝病的宿主遗传易感性的研究
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表文章目录
• 附件