mTOR基因转染对NIH3T3成纤维细胞增殖的影响及其作用机制研究

论文摘要

目的观察哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target ofrapamycin,mTOR）基因转染NIH3T3成纤维细胞后细胞增殖情况及对分泌纤连蛋白（fibronectin,FN）的影响,并以雷帕霉素（rapamycin）进行干预,检测Akt-mTOR-p70S6K信号通路中各信号分子及FN的表达,以探讨mTOR基因对成纤维细胞增殖及分泌FN的影响及机制。方法以氯化钙制备感受态细胞法制备感受态细胞并转化pcDNA3.0-mTOR重组质粒,培养扩增后以碱裂解法抽提质粒,经酶切及DNA测序鉴定,然后通过电穿孔法将质粒转染NIH3T3成纤维细胞,以G418筛选,扩大培养后获得稳定转染细胞株。以雷帕霉素干预转染细胞和非转染细胞,采用MTT法检测细胞增殖力,RT-PCR、Western blot等方法检测细胞Akt、mTOR、p70S6K和FN的表达。应用SPSS11.0统计软件对数据进行统计学分析,计量资料以（?）±s表示,组间比较采用t检验和F检验;计数资料组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差别有显著性统计学意义。结果（1）提取的质粒浓度为296ng/μL,OD260/OD280为1.88。双酶切鉴定可见目的基因片段,DNA测序进一步证实为目的基因。（2）mTOR基因转染成纤维细胞后各基因及蛋白表达的检测结果:mTOR mRNA表达,mTOR/GAPDH光密度值在转染组、对照组分别为0.68±0.03、0.38±0.03（P＜0.01）;mTOR蛋白表达,mTOR/GAPDH灰度值在转染组、对照组分别为0.79±0.04和0.57±0.01（P＜0.01）。FN mRNA表达,FN/GAPDH光密度值在转染组、对照组分别为0.63±0.07、0.39±0.03（P＜0.01）;FN蛋白表达,FN/GAPDH灰度值在转染组、对照组分别为0.77±0.07和0.55±0.04（P＜0.01）。Akt mRNA表达,Akt/GAPDH光密度值在转染组、对照组分别为0.41±0.07、0.39±0.02（P＞0.05）;Akt蛋白表达,Akt/GAPDH灰度值在转染组、对照组分别为0.65±0.02和0.63±0.03（P＞0.05）。p70S6KmRNA表达,p70S6K/GAPDH光密度值在转染组、对照组分别为0.69±0.03、0.34±0.02（P＜0.01）;p70S6K蛋白表达,p70S6K/GAPDH灰度值在转染组、对照组分别为0.75±0.06、0.53±0.05（P＜0.01）。MTT（A值）检测结果:在各时间点A值转染组大于对照组（P＜0.01）。（3）雷帕霉素干预转染前后检测结果:Akt mRNA表达:Akt/GAPDH光密度值在转染组、对照组、雷帕霉素干预转染组、雷帕霉素干预对照组分别为0.4±0.06、0.39±0.02、0.41±0.05、0.39±0.04。转染组光密度值与其他三组及其他三组之间均无显著性差异（P＞0.05）。Akt蛋白表达:Akt/GAPDH灰度值在转染组、对照组、雷帕霉素干预转染组、雷帕霉素干预对照组分别为0.66±0.02、0.63±0.04、0.67±0.07、0.64±0.05,转染组灰度值与其他三组及其他三组之间均无显著性差异（P＞0.05）。p70S6K mRNA表达:p70S6K/GAPDH光密度值在转染组、对照组、雷帕霉素干预转染组、雷帕霉素干预对照组分别为0.70±0.03、0.34±0.04、0.35±0.02、0.33±0.06。转染组光密度值大于其他三组（P＜0.01）,其他三组之间无显著性差异（P＞0.05）。p70S6K蛋白表达:p70S6K/GAPDH灰度值在转染组、对照组、雷帕霉素干预转染组、雷帕霉素干预对照组分别为0.76±0.05、0.54±0.04、0.52±0.01、0.53±0.03。转染组灰度值大于其他三组（P＜0.01）,其他三组之间无显著差异（P＞0.05）。FN mRNA表达:FN/GAPDH光密度值在转染组、对照组、雷帕霉素干预转染组、雷帕霉素干预对照组分别为0.64±0.04、0.40±0.05、0.40±0.03、0.41±0.03。转染组光密度值大于其他三组（P＜0.01）,其他三组之间无显著差异（P＞0.05）。FN蛋白表达:FN/GAPDH灰度值在转染组、对照组、雷帕霉素干预转染组、雷帕霉素干预对照组分别为0.76±0.03、0.53±0.01、0.54±0.02、0.54±0.05。转染组灰度值大于其他三组（P＜0.01）,其他三组之间无显著性差异（P＞0.05）。MTT（A值）检测结果:在各时间点A值转染组大于雷帕霉素干预转染组及对照组、雷帕霉素干预对照组（P＜0.01）,后三组各时间点A值无显著性差异（P＞0.05）。结论（1）mTOR基因使成纤维细胞增殖力增强,FN表达增强。（2）mTOR基因通过Akt-mTOR-p70S6K信号通路发挥作用,不一定依赖Akt的激活。（3）雷帕霉素可通过阻断mTOR-p70S6K信号通路而抑制成纤维细胞增殖及FN的合成。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 前言
• 第一章 质粒pcDNA3.0-mTOR的提取与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二章 mTOR基因转染对NIH3T3成纤维细胞增殖及其分泌纤连蛋白的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三章 Akt-mTOR-p70S6K信号通路与NIH3T3成纤维细胞增殖
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四章 雷帕霉素对mTOR基因诱导的NIH3T3细胞增殖的影响和可能机制
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果