卵丘细胞对小鼠卵母细胞胞质成熟的作用及机理的研究

论文摘要

获取高质量的体外成熟卵母细胞是成功进行人类体外受精、动物胚胎生产和克隆的关键。尽管动物卵母细胞能够在体外自发完成细胞核成熟,但卵母细胞成熟质量远不如体内成熟卵母细胞,其受精后胚胎发育能力较差。目前认为,这可能是由于体外成熟的卵母细胞胞质成熟不充分造成的。研究表明,卵母细胞体外成熟培养系统与受精率和囊胚发育率有强相关性。所以,继续深入认识卵母细胞的成熟规律、改善体外成熟培养环境、建立一种完善的卵母细胞体外成熟系统是当前胚胎工程研究的重要内容之一。尽管研究证明,卵泡细胞在卵母细胞胞质成熟过程中起到了重要的作用,但对于不同类型细胞发挥的具体作用以及作用机制的理解还比较匮乏。在本研究中,我们建立了一种小鼠裸卵与卵丘细胞共培养的实验模型,主要研究目的有两点:第一,深入探讨卵丘细胞支持卵母细胞胞质成熟的作用机制;第二,通过改善体外成熟培养系统,最大限度的提高裸卵的体外成熟及发育能力,为生发泡移植和GV期卵母细胞冷冻保存等技术提供有效的裸卵成熟方法。本论文主要探讨了体细胞类型、卵丘细胞与卵母细胞之间的接触及缝隙连接以及促性腺激素对共培养效果的影响;研究了成熟促进因子(MPF)活性和卵母细胞核成熟进程对小鼠卵母细胞胞质成熟的影响;观察了透明带硬化、皮质颗粒(CGs)的重分布及胞吐、谷胱甘肽(GSH)含量、纺锤体的组装和线粒体的分布等反应卵胞质成熟的指标。结果表明:1.体外成熟的小鼠卵母细胞,其最佳孤雌激活卵龄为培养26小时,最佳激活方案为含10mM SrCl2和5μg/ml CB的CZB激活处理2.5小时,之后转入含5μg/mlCB的CZB中继续培养3.5小时。2.与卵丘细胞单层共培养能够显著提高裸卵(DOs)的成熟率和囊胚发育率,与输卵管上皮细胞或胎儿成纤维细胞单层共培养仅仅能够提高DOs的核成熟率,壁颗粒细胞对DOs的核成熟和发育无作用。对卵丘细胞来讲,来自GV期卵母细胞的卵丘细胞其支持DOs成熟及发育的能力要显著好于从MII期卵母细胞中获得的卵丘细胞。3.卵丘细胞与卵母细胞之间不需要紧密接触,卵丘细胞单层条件化培养液也能提高DOs的成熟和发育能力。4.DOs与卵丘卵母细胞复合体(COCs)或分散卵丘细胞(DCCs)共培养时,随着卵丘细胞密度的增加,共培养的效果也越发明显。5.取卵前如果将注射PMSG的刺激时间从46小时缩短到24小时,体外成熟的卵母细胞的胞质成熟质量显著降低;与卵丘细胞共培养能显著提高注射PMSG后24小时取卵的COCs和DOs的胞质成熟能力;共培养系统中,如果卵母细胞成熟培养液中缺少PMSG,这将会严重削弱卵丘细胞支持卵母细胞胞质成熟的能力。6.尽管体外成熟的COCs与DOs的GSH水平差异不显著,但共培养也能够提高DOs的受精能力。7.通过DOs与卵丘细胞共培养,能够反映卵母细胞胞质成熟的其它一些指标也得到了一定程度的改善。与卵丘细胞共培养的DOs(coDOs),其核成熟进程及MPF活性较DOs单独培养时更加接近于体内成熟卵的情况。与卵丘细胞共培养能够显著降低DOs的CGs发生成熟前胞吐的几率;与卵丘细胞共培养能够有效地缓解DOs的透明带硬化程度;coDOs与DOs相比,具有正常纺锤体形状的卵母细胞的比例显著增加,具有完全极化线粒体分布状态的卵母细胞的比例显著增加。综合上述研究结果说明,卵丘细胞以组织特异性和激素依赖性方式产生了一种或一些可溶性因子,这些可溶性因子可能通过调控卵母细胞的MPF活性和减数分裂进程来促进卵母细胞的胞质成熟。

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中文摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 卵母细胞的成熟

1.2 卵丘细胞在卵母细胞成熟、排卵和受精过程中的作用

1.2.1 卵丘细胞在卵母细胞成熟过程中的作用

1.2.2 卵丘细胞对排卵的作用

1.2.3 卵丘细胞在卵母细胞受精过程中的作用

1.3 卵母细胞体外成熟共培养体系的研究进展

1.4 标示卵母细胞胞质成熟质量的其它指标

1.4.1 卵母细胞的MPF 活性变化

1.4.2 卵母细胞中的谷胱甘肽

1.4.2.1 GSH 在卵母细胞成熟、受精及早期胚胎发育过程中的作用

1.4.2.2 哺乳动物卵母细胞成熟过程和受精后GSH 水平变化

1.4.2.3 成熟环境和卵丘细胞对卵母细胞GSH 合成的影响

1.4.3 卵母细胞的皮质颗粒迁移及胞吐

1.4.3.1 哺乳动物卵母细胞成熟过程中CGs 迁移和重新分布

1.4.3.2 影响CGs 迁移和重分布的因素

1.4.3.3 CGs 胞吐与卵母细胞受精及透明带硬化

1.4.4 卵母细胞的纺锤体组装

1.4.5 卵母细胞的线粒体重分布

2. 材料与方法

2.1 主要试剂及配制

2.2 实验动物及超排处理

2.3 卵母细胞的获取及体外成熟

2.4 体内成熟卵母细胞的获取

2.5 体细胞单层的制备及共培养

2.5.1 卵丘颗粒细胞单层的培养

2.5.2 壁颗粒细胞单层的培养

2.5.3 小鼠胎儿成纤维细胞单层的培养

2.5.4 小鼠输卵管上皮细胞单层的培养

2.5.5 体细胞单层与卵母细胞共培养

2.6 卵丘细胞条件化培养液的制备

2.7 卵母细胞的孤雌激活

2.7.1 乙醇结合6-DMAP 激活

2.7.2 氯化锶激活

2.8 卵母细胞的体外受精

2.9 胚胎培养

2.10 卵母细胞的核进程观察

2.11 透明带硬化测试

2.12 MPF 活性检测

2.12.1 实验材料的制备

2.12.2 蛋白磷酸化反应

2.12.3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.12.4 放射自显影

2.12.5 MPF 活性的定量研究

2.13 卵母细胞谷胱甘肽含量的测定

2.14 皮质颗粒染色

2.15 卵母细胞纺锤体（Α－微管蛋白）染色

2.16 卵母细胞线粒体染色

2.17 激光扫描共聚焦显微术

2.18 实验设计

2.18.1 小鼠裸卵体外成熟模型的建立

2.18.1.1 超排处理时间不同对卵母细胞体外成熟的影响

2.18.1.2 体外成熟卵母细胞最佳激活方案及激活卵龄的研究

2.18.2 卵丘细胞共培养对小鼠裸卵体外成熟及发育能力的改善

2.18.2.1 超排处理时间及卵丘细胞共培养对卵母细胞（COCs、DOs）体外成熟及发育的影响

2.18.2.2 卵丘颗粒细胞条件化培养液对卵母细胞体外成熟及发育的影响

2.18.2.3 卵丘卵母细胞共培养体系中卵丘细胞存在方式及卵丘细胞密度对卵母细胞成熟及发育的影响

2.18.2.4 不同体细胞类型共培养对小鼠裸卵成熟及发育的影响

2.18.2.5 体细胞培养液或卵母细胞成熟培养液中是否添加促性腺激素对小鼠裸卵成熟和发育的影响

2.18.2.6 卵丘细胞共培养对卵母细胞体外受精及透明带硬化程度的影响

2.18.3 能够反应卵母细胞胞质成熟质量的其它细胞器及激酶活性检测

2.19 数据统计分析

3. 结果与分析

3.1 小鼠裸卵体外成熟模型的建立

3.1.1 小鼠卵母细胞体外培养成熟时间的研究

3.1.2 体外成熟小鼠卵母细胞最佳激活方案及激活卵龄的研究

3.2 卵丘细胞共培养改善小鼠裸卵体外成熟及发育能力

3.2.1 超排处理时间及卵丘细胞共培养对卵母细胞（COCs、DOs）体外成熟及发育的影响

3.2.2 卵丘颗粒细胞及壁颗粒细胞条件化培养液对小鼠卵母细胞体外成熟、孤雌激活及胚胎发育的影响

3.2.3 共培养系统中卵丘细胞类型及细胞密度对卵母细胞成熟、激活及发育的影响

3.2.4 不同类型体细胞共培养对小鼠裸卵成熟及发育的影响

3.2.5 卵丘细胞培养液或卵母细胞成熟培养液中是否添加促性腺激素（PMSG），对卵母细胞体外成熟及发育的影响

3.2.6 卵丘细胞共培养对卵母细胞体外受精及透明带硬化的影响

3.3 能够反映卵母细胞胞质成熟质量的其它细胞器及激酶活性检测

3.3.1 卵母细胞核进程的变化

3.3.2 卵母细胞皮质颗粒（CGs）重分布及胞吐情况的研究

3.3.3 体内和体外成熟卵母细胞MPF 活性检测

3.3.4 体内和体外成熟卵母细胞的谷胱甘肽含量检测

3.3.5 体内和体外成熟卵母细胞的纺锤体组装

3.3.6 体内和体外成熟卵母细胞的线粒体分布

4 讨论

4.1 卵丘细胞对卵母细胞成熟和发育的影响

4.2 卵丘细胞与卵母细胞之间的缝隙连接及卵丘细胞密度对卵母细胞成熟和发育的影响

4.3 卵丘细胞产生的促卵母细胞胞质成熟作用具有促性腺激素依赖性

4.4 卵母细胞的 GSH 含量变化

4.5 卵丘细胞共培养能显著提高 DOS 的受精能力

4.6 卵丘细胞共培养对DOs核成熟进程、MPF活性、纺睡体组装及线粒体分布的影响

5 结论

参考文献

附录：图版及图版说明

致谢

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