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A、B亚群禽白血病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

2020-12-13阅读(733)

A、B亚群禽白血病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

论文摘要

禽白血病（Avian Leukosis,AL）是由禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus,ALV）引起的以肿瘤发生和免疫抑制为特征的世界范围的禽类疾病。禽白血病病毒属于反转录病毒科,α反转录病毒属。感染鸡的禽白血病病毒可分为外源性的A、B、C、D、J亚群和内源性的E亚群。目前,世界各国控制禽白血病的主要方法是通过病原检测,淘汰阳性鸡,从而净化种群达到消灭本病的目的。因此,在该病的控制中及时准确的诊断就显得尤为重要。目前,基于核酸扩增的分子生物学诊断技术如PCR、实时荧光定量PCR等在病原微生物的检测以及疾病诊断方面发挥着重大作用,但这些方法要么需要精密仪器,要么要求操作人员具备较高的专业知识和操作技能,因此不利于在基层推广,无法满足简单、快速、准确诊断的要求。而传染病的防控和治疗的关键在于对病原微生物的快速、准确的检测并确诊。因此,建立一种快速、准确的新型诊断技术迫在眉睫。本研究根据序列对比结果和禽白血病亚群间序列特征,针对gp85区段设计了两组分别用于检测A、B亚群禽白血病的LAMP引物。通过对反应条件的优化,使得A、B亚群的LAMP检测方法不与除本身亚群外的其它禽白血病主要亚群发生交叉反应,同时也不与其它常见的禽类传染病发生非特异性反应。ALV-A的LAMP方法敏感性试验表明:该方法能够在45分钟内检测出20个拷贝的病毒核酸,比常规PCR敏感100倍。ALV-B的LAMP方法敏感性试验表明:该方法在80min内能够检测出4000个拷贝的病毒核酸,与普通PCR敏感度相当。LAMP检测方法的建立实现了对A、B亚群的快速检测,而且可通过添加荧光染料FDR,使其反应前后颜色发生显著变化来进行判定,实现了反应产物的可视化。整个反应过程不需要开盖,极大地减少了污染的可能性,具有现地应用的前景。综上所述,本研究成功建立了A、B亚群禽白血病的LAMP检测方法。为今后的相关研究奠定了理论基础。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 1 前言
  • 1.1 研究的目的与意义
  • 1.2 文献综述
  • 1.2.1 禽白血病
  • 1.2.2 禽白血病病毒
  • 1.2.3 病毒基因组的结构和功能
  • 1.2.4 禽白血病病毒的致病机制
  • 1.2.5 禽白血病检测方法的研究进展
  • 1.3 环介导等温扩增（LAMP）技术
  • 1.3.1 环介导等温扩增方法引物设计
  • 1.3.2 环介导等温扩增方法基本原理
  • 1.3.3 环介导等温扩增方法特点
  • 2 材料与方法
  • 2.1 菌株来源
  • 2.2 试验材料、仪器
  • 2.2.1 常用试剂
  • 2.2.2 试剂配制
  • 2.2.3 仪器设备
  • 2.3 A 亚群禽白血病病毒LAMP 检测方法的建立
  • 2.3.1 病毒的培养与增殖
  • 2.3.2 病毒基因组的提取
  • 2.3.3 质粒标准品的构建
  • 2.3.4 ALV-A LAMP 引物的设计
  • 2.3.5 ALV-A LAMP 反应时间、温度的优化
  • 2.3.6 ALV-A LAMP 与其它亚群的区分
  • 2.3.7 ALV-A LAMP 的特异性试验
  • 2.3.8 ALV-A LAMP 的敏感性试验
  • 2.3.9 ALV-A 临床样品的检测
  • 2.4 B 亚群禽白血病病毒LAMP 检测方法的建立
  • 2.4.1 病毒的培养与增殖
  • 2.4.2 病毒基因组的提取
  • 2.4.3 质粒标准品的构建
  • 2.4.4 ALV-B LAMP 引物的设计
  • 2.4.5 ALV-B LAMP 反应时间、温度的优化
  • 2.4.6 ALV-B LAMP 与其它亚群的区分
  • 2.4.7 ALV-B LAMP 的特异性试验
  • 2.4.8 ALV-B LAMP 的敏感性试验
  • 2.4.9 ALV-B 临床样品的检测
  • 3 结果与分析
  • 3.1 A 亚群禽白血病LAMP 检测方法的建立
  • 3.1.1 ALV-A LAMP 质粒标准品的构建
  • 3.1.2 ALV-A LAMP 引物的筛选
  • 3.1.3 ALV-A LAMP 不与禽白血病的其它亚群发生交叉反应
  • 3.1.4 ALV-A LAMP 检测方法的特异性
  • 3.1.5 ALV-A LAMP 具有较高的敏感性
  • 3.1.6 ALV-A 临床样品的检测
  • 3.2 B 亚群禽白血病LAMP 检测方法的建立
  • 3.2.1 ALV-B LAMP 质粒标准品的构建
  • 3.2.2 ALV-B LAMP 引物的筛选
  • 3.2.3 ALV-B LAMP 不与禽白血病的其它亚群发生交叉反应
  • 3.2.4 ALV-B LAMP 不与其它常见的禽类传染病发生非特异性反应
  • 3.2.5 ALV-B LAMP 具有较高的敏感性
  • 3.2.6 ALV-B 临床样品的检测
  • 4 讨论
  • 4.1 病毒增殖
  • 4.2 质粒标准品的制备
  • 4.3 LAMP 的特异性
  • 4.4 LAMP 的敏感性
  • 4.4.1 ALV-A LAMP 检测
  • 4.4.2 ALV-B LAMP 检测
  • 4.5 LAMP 的可视化
  • 4.6 A、B 亚群LAMP 检测方法建立的必要性
  • 4.6.1 A 亚群LAMP 检测方法建立的必要性
  • 4.6.2 B 亚群LAMP 检测方法建立的必要性
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文

    • 相关论文文献

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