论文摘要
目的：研究Shh蛋白对大鼠永久性脑缺血模型的保护作用及其潜在机制。方法：原代大鼠脑微血管内皮细胞1-2代后，应用糖氧剥夺模拟体外缺血模型，分别给予rHu Shh、Cyclopamine预处理，选取2小时、4小时或6小时三个作用时间点为检测终点，用MTT法或BrdU染色法检测细胞存活和细胞增殖；建立大鼠永久性脑缺血模型，侧脑室注射rHu Shh或PBS，观察神经行为学评分，应用TTC法检测脑梗塞面积，干湿称重法检测脑水肿，依文思蓝外渗法检测血脑屏障通透性，激光散斑衬比技术检测皮层血流灌注，免疫组织化学法检测缺血梗塞区边缘CD31和α-SMA的阳性表达，用CD31和Ki-67两种抗体进行免疫荧光双标，用共聚焦显微镜观察缺血梗塞区边缘内皮细胞增殖状况。应用实时荧光定量PCR的方法检测Sonic hedgehog（Shh）信号通路中的关键成份（Shh，Patched-1，Gli-1）及血管新生因子（VEGF、Ang-1和Ang-2）的mRNA水平，用免疫印迹法（Western blotting）检测上述因子的蛋白水平。结果：1)rHu Shh可促进OGD处理下原代培养的脑微血管内皮细胞的存活和增殖能力；2)大鼠永久性脑缺血模型后24小时可见脑组织Shh，Patched-1，Gli-1的mRNA水平和蛋白水平的表达增高，而侧脑室给予rHu Shh可以进一步提高Patched-1的蛋白表达水平；3)侧脑室给予rHu Shh可以显著减轻脑缺血导致的神经功能缺损，降低梗塞面积，减轻脑水肿，改善血脑屏障通透性，提高皮层血流灌注；4)侧脑室给予rHu Shh可以增加缺血梗塞区边缘CD31和α-SMA阳性表达的细胞，增加CD31和Ki-67共定位的阳性细胞；5)侧脑室给予rHu Shh，在大鼠永久性脑缺血模型后24小时的脑组织可见VEGF和Ang-1的mRNA水平和蛋白水平的表达增高。结论：Shh对缺血损伤的脑微血管内皮细胞具有保护作用；脑缺血后Shh信号通路存在激活；外源性给予Shh可调控血管新生因子的表达，促进血管新生和血管成熟，增加皮层血流灌注，改善血脑屏障通透性，减轻脑梗塞面积和脑水肿程度，进而改善神经功能缺损。提示Shh对缺血性脑损伤具有一定的保护作用，可能成为脑缺血的治疗靶点。
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