溶组织内阿米巴14-3-3蛋白功能初探

论文摘要

目的:预测溶组织内阿米巴14-3-3（Eh14-3-3）蛋白的结构与功能,克隆与鉴定溶组织内阿米巴14-3-3基因,并纯化重组Eh14-3-3蛋白,分析纯化产物的免疫学特性,制备抗重组Eh14-3-3蛋白血清,比较不同内阿米巴属虫株14-3-3蛋白序列,探讨14-3-3蛋白作为研究遗传进化标记分子的可能性。方法:利用生物信息学网站的各种在线工具和Vector NTI Suite软件包对溶组织内阿米巴14-3-3（Eh14-3-3）基因进行分析和功能预测,分别以溶组织内阿米巴HM1∶IMSS株滋养体总RNA逆转录合成的cDNA链和基因组DNA为模板,设计合成引物,PCR扩增Eh14-3-3蛋白编码基因序列,克隆入pET19b载体,并用双酶切法和DNA测序进行鉴定。在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,用树脂层析纯化目的蛋白。SDS-PAGE鉴定,并用ELISA鉴定纯化产物的免疫学特性,检测病人和正常人血清对其的反应性,继而以之免疫小鼠制备抗血清。随后分别扩增各不同内阿米巴虫株滋养体的14-3-3蛋白编码基因序列,并对它们进行了比较分析。结果:溶组织内阿米巴具有三种Eh14-3-3蛋白编码基因的异构体,与GenBank收录（编号分别为EHU13418,EHU13419,EHU13420）的Eh14-3-3蛋白编码基因一致。重组Eh14-3-3蛋白,通过纯化层析,30kD附近得到单一蛋白条带。ELISA等实验证实纯化得到的Eh14-3-3蛋白与慢性反复发作者血清和阿米巴结肠炎病人血清有反应,与包囊携带者血清、急性阿米巴肝脓疡患者血清和正常人血清无明显反应。抗重组Eh14-3-3蛋白血清的与溶组织内阿米巴粗抗原ELISA反应的效价为1∶200,但随后的细胞定位实验为阴性。不同内阿米巴属虫株的14-3-3蛋白序列比较结果提示内阿米巴属14-3-3基因高度保守,生物信息学分析还提示该蛋白是研究物种进化的理想分子。结论:溶组织内阿米巴含有三个14-3-3蛋白的异构体,它们可能在溶组织内阿米巴的成囊过程中发挥重要作用。14-3-3蛋白是研究物种进化有用的靶分子。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 Eh14-3-3蛋白的生物信息学预测和基因克隆及鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 Eh14-3-3重组蛋白的免疫学特性分析和抗血清的制备
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 不同种及株阿米巴间14-3-3蛋白编码基因的比较
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 综述 寄生虫中的14-3-3蛋白
• 致谢