姜叶斑病病原菌的鉴定及其对苯并咪唑类杀菌剂抗性机制的初探

论文摘要

近年来山东莱芜姜田发现一种严重危害生姜的病害,本文对引起该病害的病原菌,进行了形态学观察、致病性测定以及rDNA-ITS序列分析。研究结果表明:该病原菌菌落在PDA培养基上初呈白色,后期逐渐变成褐色,菌丝分枝,具隔膜,无色或淡褐色;分生孢子椭圆形、卵形,无色,单胞,两端各含有一油球;产孢细胞内壁芽生瓶梗式（eb-ph）。其rDNA-ITS序列与GenBank中的茎点霉（Phoma）同源性高达95.6%,远远高于与叶点霉的同源性（58.7%）。结合形态学特征和致病性测定,鉴定该菌为姜茎点霉Phoma zingiberi（Hori）X. P. Zhu & Y. L. Liu。对姜叶斑病菌生物学特性的研究结果表明:姜叶煎汁培养基是该菌的最适生长培养基,菌丝生长最适温度为25℃,最适pH为5,以纤维二糖为碳源的PD培养基和以蛋白胨为氮源的基本培养基最有利于菌丝的生长。孢子萌发最适温度范围为1520℃,最适pH范围为56,并需较高的相对湿度,以饱和湿度条件下孢子的萌发率最高。多菌灵是用于防治姜叶斑病的主要药剂。本文对在不同地块采集到的感病叶片进行分离培养,对多菌灵的敏感性测定得出2种表型:其中有62个菌株对多菌灵表现抗性,占测定菌株总数的31%,138个为多菌灵敏感菌株。随机挑选4个抗性菌株和2个敏感菌株,克隆了其β-微管蛋白基因,比较敏感菌株和抗性菌株β-微管蛋白基因的序列发现,抗性菌株198位氨基酸发生了突变,由原来的Glu（GAG）突变为Ala（GCG）,其它位点未发现突变,说明姜叶斑病菌对多菌灵的抗药性与β-微管蛋白198位氨基酸突变有关。首次阐明了姜叶斑病菌对多菌灵的抗性机制。本文利用分子检测技术对田间抗性菌株进行了检测,从而为合理用药、及时调整抗药性治理策略提供依据。目前国内外有关文献报道认为,引起姜叶斑病的病原菌为姜叶点霉Phyllosticta zingiberi Hori。本文通过传统的形态学方法和现代的分子生物学技术对引起姜叶斑病的病原菌的分类地位进行了重新划分。对其生物学特性的研究为研究该病害的发生流行规律提供了理论依据。本研究首次明确了姜叶斑病菌对多菌灵抗药性的分子机制,获得了该病原菌β-微管蛋白基因部分序列,并确定了抗性突变位点,在此基础上可利用现代DNA技术快速、简便的检测和监测田间抗药性菌株,对于及时了解抗药性病原群体的发展动态,及时、合理的科学用药,有效的治理抗药性,以及降低成本和减少环境污染等具有现实意义。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言与综述
• 1. 姜病害的种类及病原菌
• 2. 真菌分类系统演变
• 2.1 真菌的形态学及其研究技术
• 2.2 真菌的分子生物学及其研究技术
• 2.2.1 真菌DNA 碱基组成的分类鉴定方法
• 2.2.2 核酸分析技术
• 3. 球壳孢目真菌种级分类与寄主植物的关系
• 4. 球壳孢目真菌分生孢子的发育和超微结构与分类的关系
• 5. 现代杀菌剂抗性研究进展
• 5.1 苯并咪唑类杀菌剂的抗性现状
• 5.2 苯并咪唑类杀菌剂的抗药性类型及抗药性机制
• 5.3 杀菌剂的抗药性检测
• 5.3.1 传统的抗药性检测
• 5.3.2 抗药性的分子检测
• 第二章 姜叶斑病病原鉴定
• 1. 病原菌的分离与鉴定
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 姜叶斑病症状描述
• 1.1.2 实验材料
• 1.1.3 主要试剂及仪器
• 1.1.4 实验中的培养基
• 1.2 病原菌的分离纯化及鉴定
• 1.2.1 病原菌的分离纯化
• 1.2.2 致病性测定
• 1.3 病原菌的初步鉴定
• 1.3.1 病原菌培养性状的观察
• 1.3.2 病原菌菌体形态的观察
• 1.4 利用RDNA 序列分析对病原菌的鉴定
• 1.4.1 病原菌基因组DNA 的提取
• 1.4.2 核糖体DNA ITS 区域的PCR 扩增
• 1.4.3 PCR 扩增产物的检测及回收
• 1.4.4 病原菌ITS 序列的测定
• 1.4.5 病原菌ITS 序列的分析
• 1.5 病原菌生物学特性的测定
• 1.5.1 培养基对菌丝生长的影响
• 1.5.2 温度对菌丝生长的影响
• 1.5.3 pH 值对菌丝生长的影响
• 1.5.4 不同碳源对菌丝生长的影响
• 1.5.5 不同氮源对菌丝生长的影响
• 1.5.6 光照对菌丝生长的影响
• 1.5.7 温度对孢子萌发的影响
• 1.5.8 湿度对孢子萌发的影响
• 1.5.9 pH 值对孢子萌发的影响
• 2. 结果与分析
• 2.1 病原菌的分离纯化
• 2.2 病原菌的致病性测定
• 2.3 病原菌的形态学鉴定
• 2.4 病原菌核糖体DNA ITS 区域序列测定和分析
• 2.4.1 基因组DNA 的提取和核糖体ITS 区域的扩增
• 2.4.2 核糖体DNA ITS 序列分析
• 2.5 病原菌生物学特性的测定
• 2.5.1 培养基对菌丝生长的影响
• 2.5.2 温度对菌丝生长的影响
• 2.5.3 pH 对菌丝生长的影响
• 2.5.4 不同碳源对菌丝生长的影响
• 2.5.5 不同氮源对菌丝生长的影响
• 2.5.6 光照对菌丝生长的影响
• 2.5.7 温度对菌株孢子萌发的影响
• 2.5.8 湿度对菌株孢子萌发的影响
• 2.5.9 pH 值对菌株孢子萌发的影响
• 3. 讨论与结论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 3.2.1 姜叶斑病病害的发生
• 3.2.2 姜叶斑病菌的分类地位
• 3.2.3 生物学特性的研究
• 第三章 姜叶斑病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性机制及分子检测
• 1. 菌株药剂敏感性测定
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 药剂敏感性测定
• 1.1.3 菌株β-微管蛋白基因的PCR 扩增
• 1.1.4 菌株β-微管蛋白基因的克隆
• 1.1.5 序列同源性分析和突变位点的比较
• 1.1.6 突变位点的检测
• 2. 结果与分析
• 2.1 药剂敏感性测定
• 2.2 菌株Β-微管蛋白基因的PCR 扩增及序列测定
• 2.3 姜叶斑病菌Β-微管蛋白基因序列同源性分析及突变位点的比较
• 2.4 突变位点的检测
• 3. 结论与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况
• 附录