论文题目: 睾丸特异蛋白激酶TSSK4的基因克隆及功能初探
论文类型: 博士论文
论文专业: 遗传学
作者: 陈秀娟
导师: 赵寿元
关键词: 睾丸组织特异性丝氨酸,苏氨酸激酶,酵母双杂交,磷酸化,精子发生
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 蛋白激酶通过对蛋白底物的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的磷酸化而完成对蛋白质的翻译后修饰,这一过程在许多细胞活动中起着十分重要的作用,例如,细胞外信号传导,细胞内运输,细胞周期进程等。蛋白激酶在细胞机制和信号传导过程中起着重要的作用,在精子发生的过程中也发现了一些起作用的蛋白激酶。然而,只有很少一部分激酶是专一地在生殖细胞或睾丸组织中表达。 我们通过EST同源筛选的方法,用TSSK(testis-specific serine/threonine kinase)1,2,3的cDNA为信息探针在GenBank数据库中发现了一个新的同源基因,在人的睾丸组织cDNA文库中将其克隆,该cDNA序列包含了984个碱基的开放阅读框,编码一个328个氨基酸的蛋白质。该蛋白质具有一个保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,氨基酸序列比较显示这个新的推导蛋白与TSSK1,TSSK2,TSSK3有较高的同源性,可能是这个亚家族的第四个成员,故命名为TSSK4。同样的方法获得小鼠的同源基因tssk4。组织表达谱分析表明TSSK4也只在睾丸组织中表达,免疫组化定位分析表明tssk4主要在小鼠睾丸中的单倍体的圆形精子细胞中表达。 为了研究TSSK4的生理功能,我们选择以酵母双杂交的方法筛选互作蛋白作为切入点,从人的睾丸cDNA文库中筛选到了一个能与TSSK4互作的蛋白——cAMP应答元件结合蛋白CREB。体外GST pull-down实验和磷酸化试验表明,TSSK4不仅能与CREB相互作用,而且能够使CREB磷酸化。为了进一步确定TSSK4磷酸化CREB的生理意义,我们在人的胚肾细胞Hek 293T细胞中用CRE(cAMP responsive element)报告系统检测TSSK4的调节功能。结果表明,TSSK4能够增强依赖于CRE的基因转录。这些结果提示TSSK4可能是通过磷酸化CREB,调节CRE依赖的基因转录而参与精子的发生过程。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
前言
材料和方法
一、材料和试剂
1．菌株、质粒、细胞株和实验动物
2．实验耗材及试剂
3．常用试剂配置
4．引物
二、主要的仪器设备
三、主要的计算机分析软件
四、技术路线与实验方法
1．设计思路与实验流程
2．TSSK4基因的克隆
3．组织表达谱分析
4．表达载体的构建
5．TSSK4多克隆抗体的制备
6．tssk4在不同发育期小鼠睾丸中的表达检测
7．免疫组化分析tssk4在小鼠睾丸中的定位
8．细胞培养和瞬时表达
9．酵母双杂交系统筛选与TSSK4相互作用的蛋白
10．GST pull-down实验
11．免疫荧光检测两种蛋白的细胞亚定位
12．TSSK4的体外激酶实验
13．双荧光素酶报告反应系统检测荧光素酶活性
结果
1．TSSK4基因的克隆和序列分析
2．TSSK4基因的染色体定位和基因组结构分析
3．TSSK4基因的组织表达谱分析
4．TSSK4多克隆抗体的制备
5．tssk4在不同发育期的小鼠睾丸中的表达
6．tssk4在小鼠睾丸中的定位
7．在酵母中TSSK4与CREB是一对互作蛋白
8．体外试验证明TSSK4能与CREB互作，并使其磷酸化
9．TSSK4对CRE参与的信号通路的影响
讨论
小结
参考文献
综述
致谢
发布时间: 2005-09-19
参考文献
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