转金属硫蛋白基因水稻的特异表达及其对重金属抗性的研究

论文摘要

哺乳动物金属硫蛋白（Metallothioneins简称MTs）是一类低分子量,富含半胱氨酸的金属结合蛋白。由于其具有重金属解毒的功能,我们将小鼠金属硫蛋白基因（mMT）克隆在绿色组织特异表达启动子和组成型启动子35S的下游,构建了植物表达载体pCAMBIO1301RSmMT﹑pCAMBIO1301ASmMT和pCAMBIO130135SmMT,并将其导入农杆菌AGL0中,用农杆菌侵染法转化水稻,通过水稻植株的再生和抗生素筛选,成功的得到了转基因水稻植株。以mMT cDNA为探针对T0和T1代转基因水稻进行了Southern blot检测,证明外源基因确实整合到水稻基因组内并稳定传递到后代;以mMT cDNA为探针进行Northern blot杂交,检测到不同启动子引导的金属硫蛋白在转基因水稻的不同组织中的表达。35S组成型启动子引导的mMT在转基因水稻的根部和叶部都有mMT的表达;而绿色组织表达启动子引导的MT只在转基因水稻的叶部检测到MT的表达,在根部没有检测到MT的表达。Western blot结果证明了外源基因在蛋白质水平上的表达。为了探讨水稻金属硫蛋白（rMT）在重金属结合方面的功能﹑RNAi抑制基因表达的功效及与小鼠金属硫蛋白的功能关系,我们又克隆了水稻金属硫蛋白的三个基因并将其融合,构建了水稻金属硫蛋白RNA干涉表达载体pJRrMT1a﹑pJRMT2a﹑pJRrMT3a和pJRrMT123a,导入农杆菌GV3101中,用农杆菌侵染法转化水稻,通过愈伤组织的形成,芽﹑根的形成,用抗生素筛选,成功的得到了转基因水稻植株,通过对转基因水稻株系的T0和T1代PCR和Southern blot检测,证明外源基因确实整合到水稻基因组内并稳定地传递到后代;以水稻金属硫蛋白基因全长设计引物,以水稻ACT1作为内源参照,进行半定量RT-PCR,检测到转基因水稻mRNA有不同程度的降解。通过对不同表达系统转基因水稻T1代株系抗生素筛选分析表明,转基因水稻植株的抗生素抗性在后代中得到了保持。不同转基因株系在含有相应抗生素的水溶液中萌发时表现出不同的抗性分离比,说明外源基因在植物染色体内可能有不同的整合拷贝数。对转mMT基因水稻T1代株系抗重金属分析表明,转mMT基因水稻的T1和对照中花11对Cd2+的抗性有明显差异,在含有不同浓度Cd2+ （ 0～1.0mmol/L）的水溶液中转mMT基因植株生长正常,表现出了对Cd2+的高度抗耐性。而对照株在Cd2+0.3mmol/L的浓度下即受到毒害。原子吸收光谱测定Cd2+在转mMT基因水稻不同组织中的分布表明,特异启动子引导的mMT转基因水稻中叶部和茎中Cd2+含量明显高于根部,而35S引导的mMT转基因水稻Cd2+的含量主要在根部,叶部和茎中含量很少。Southern blot、

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 金属硫蛋白概述
• 1.1.1 金属硫蛋白的一般特点
• 1.1.2 金属硫蛋白的分类
• 1.1.3 金属硫蛋白的结构
• 1.1.4 金属硫蛋白的生物学功能
• 1.2 植物金属硫蛋白的研究进展
• 1.2.1 植物 MT 的主要特性
• 1.2.2 植物 MT 的分类
• 1.2.3 植物 MT 基因的表达
• 1.2.4 植物MT 的功能
• 1.3 植物组织特异性表达的研究
• 1.3.1 启动子的一般特点
• 1.3.2 启动子的类型
• 1.3.3 特异性启动子的应用
• 1.4 转金属硫蛋白基因植物研究与进展
• 1.5 RNA 干涉的研究进展
• 1.5.1 RNAi 概述
• 1.5.2 RNAi 作用机理
• 1.5.3 RNAi 技术
• 1.5.4 RNAi 的应用
• 1.6 立题意义及主要的技术路线
• 1.6.1 立题意义
• 1.6.2 主要的技术路线
• 第二章 转金属硫蛋白基因的特异表达系统的构建
• 2.1 前言
• 2.1.1 AtSTP3 绿色组织特异表达启动子
• 2.1.2 rbcS 绿色组织特异表达启动子
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 植物材料与动物材料
• 2.2.2 菌株与质粒
• 2.2.3 试剂与酶
• 2.2.4 仪器
• 2.2.5 小鼠总 RNA 的提取
• 2.2.6 克隆小鼠金属硫蛋白基因（MT）
• 2.2.7 拟南芥总 DNA 的提取
• 2.2.8 克隆 AtSTP3 启动子
• 2.2.9 水稻总 DNA 的提取
• 2.2.10 克隆RbcS 启动子
• 2.2.11 表达载体构建
• 2.2.12 农杆菌真空渗透法Agroinfiltration 研究GUS 瞬间表达情况
• 2.3 结果
• 2.3.1 克隆小鼠金属硫蛋白基因（m MT）
• 2.3.2 克隆 AtSTP3 启动子
• 2.3.3 克隆rbcS 启动子
• 2.3.4 表达载体的构建
• 2.3.5 两个启动子表达系统的 GUS 瞬间表达结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 从小鼠中克隆金属硫蛋白基因及序列分析
• 2.4.2 从水稻中克隆启动子及序列分析
• 2.4.3 两个特异表达启动子瞬时表达的活性
• 2.4.4 所构建系统的应用价值
• 2.5 总结
• 第三章 应用农杆菌介导的方法进行水稻遗传转化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 植物材料
• 3.2.2 菌株与质粒
• 3.2.3 试剂与酶
• 3.2.4 仪器及设备
• 3.2.5 培养基
• 3.2.6 转基因植物的获得
• 3.2.7 GUS 组织化学染色
• 3.2.8 GUS 活性定量测定
• 3.2.9 转基因水稻的分子检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 含pCAMBIA1301 质粒农杆菌的获得
• 3.3.2 转基因植株的获得
• 3.3.3 两个启动子转基因材料的 GUS 组织化学染色检测结果
• 3.3.4 两个启动子转基因材料的GUS活性定量检测结果
• 3.3.5 转基因水稻的PCR 检测
• 3.3.6 转m MT基因植株的 Southern blot检测
• 3.3.7 转mMT 基因植株的Northern blot 检测
• 3.3.8 转m MT 基因植株的 Western blot 检测
• 3.4 讨论
• 3.4.1 添加 AS 对水稻转化效率的影响
• 3.4.2 rbcS 启动子的克隆及特异表达
• 3.4.3 转基因植株Southern blot 结果
• 3.4.4 转基因沉默
• 3.5 总结
• 第四章 水稻金属硫蛋白基因RNAi 表达系统的构建及遗传转化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 植物材料
• 4.2.2 菌株与质粒
• 4.2.3 试剂与酶
• 4.2.4 克隆水稻金属硫蛋白基因
• 4.2.5 水稻金属硫蛋白基因的融合
• 4.2.6 表达载体构建
• 4.2.7 转基因植物的获得
• 4.2.8 转基因水稻的分子检测
• 4.3 结果
• 4.3.1 克隆水稻金属硫蛋白rMT1a 基因
• 4.3.2 克隆水稻金属硫蛋白rMT2a 基因
• 4.3.3 克隆水稻金属硫蛋白rMT3a 基因
• 4.3.4 融合水稻金属硫蛋白基因
• 4.3.5 含pJawoh18RNAi, pJRrMT1a ﹑pJRrMT2a﹑pJRrMT3a and pJRrMT123a质粒农杆菌的获得
• 4.3.6 转基因植株的获得
• 4.3.7 转基因植株的 PCR 检测
• 4.3.8 转基因植株的 Southern blot 检测
• 4.3.9 转基因植株的RT-PCR 检测
• 4.4 讨论
• 4.4.1 从水稻中克隆金属硫蛋白基因及序列分析
• 4.4.2 转基因植株的PCR 检测结果
• 4.4.3 转基因植株的 Southern blot 结果
• 4.4.4 转基因植株的半定量RT-PCR 检测结果
• 4.5 总结
• 第五章 转基因水稻 T1 代性状分析及对重金属抗性的研究
• 5.1 前言
• 5.1.1 重金属的污染及治理方法
• 5.1.2 利用植物基因工程的方法提高植物对重金属的抗性
• 5.1.3 利用植物基因工程的方法减少农产品中重金属的含量
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 植物材料
• 5.2.2 仪器与试剂
• 1 代种子抗嘲霉素萌发实验'>5.2.3 转mMT 基因 T₁代种子抗嘲霉素萌发实验
• 5.2.4 转水稻金属硫蛋白基因 RNA 干涉的水稻种子抗除草剂萌发实验
• 5.2.5 转基因种子抗重金属萌发实验
• 5.2.6 转基因植株抗重金属实验
• 2+分布'>5.2.7 不同启动子引导的mMT 转基因水稻组织中 Cd²⁺分布
• 2+分布'>5.2.8 转水稻金属硫蛋白基因 RNA 干涉的水稻组织中 Cd²⁺分布
• 5.3 结果
• 1 代种子抗嘲霉素实验结果'>5.3.1 转mMT 基因水稻T₁代种子抗嘲霉素实验结果
• 5.3.2 转水稻金属硫蛋白基因 RNA 干涉的水稻种子抗除草剂萌发实验
• 5.3.3 转基因种子抗重金属萌发实验结果
• 5.3.4 转基因水稻植株对重金属抗性的研究结果
• 2+含量及分布'>5.3.5 转mMT 基因水稻组织中Cd²⁺含量及分布
• 2+含量及分布'>5.3.6 转水稻金属硫蛋白基因RNA 干涉的水稻组织中Cd²⁺含量及分布
• 5.4 讨论
• 5.4.1 各个表达系统转基因水稻种子对抗生素萌发实验结果分析
• 5.4.2 各个表达系统转基因水稻对重金属抗性的差异分析
• 5.4.3 转基因水稻对环境治理的意义
• 5.4.4 转基因水稻对食品安全的意义
• 5.5 总结
• 参考文献
• 附录Ⅰ 缩写
• 附录Ⅱ:克隆载体构建流程
• 博士期间已发表与待发表的论文
• 致谢