水稻中铁吸收系统Ⅱ的抑制调控铁、锌吸收增强的分子机理研究

论文摘要

筛选EMS诱变粳稻日本晴（Nipponbare）材料，获得了一个铁吸收系统Ⅱ缺陷的突变体std（（?）rategyⅡ（?）efective）。通过在不同形式的铁营养条件下的培养，对突变体以及野生型（Nipponbare）的生长情况与金属元素含量进行了比较。经过遗传分析对突变基因进行图位克隆，并依据所克隆的基因测定了突变体所分泌的脱氧麦根酸以及内源尼克酰胺含量。利用基因芯片技术对突变体和野生型在不同条件下的基因表达差异进行了分析，结果如下：1．在柠檬酸铁（citrate-Fe）营养的条件下，突变体的生长相较于野生型受到了严重阻碍，幼苗矮小黄化，侧根与不定根伸长受阻，且侧根在主根上呈密集排列生长至靠近根尖处。在缺铁时，突变体的生长也是如此。生长于螯合铁（EDTA-Fe）营养液中时，突变体的症状被恢复。由此表明突变体可能是在铁吸收系统Ⅱ方而出现了某些缺陷。金屈元素的测定分析表明，在柠檬酸铁条件下，突变体中铁浓度明显低于野生型。在螯合铁条件时，突变体中的铁含量则要高于野生型。锌元素的含量在突变体中都显著超出野生型。对秸秆和谷粒的测定结果也表明突变体中的铁、锌元素含量都高于野生型。2．通过与Kasalath的杂交F2代群体分离比例分析，确定该突变属于单基因隐性遗传。利用SSR分子标记对2900株突变体的连锁分析，确定了第2条染色体的RM13046与RM13051之间约120kb范围。候选基因分析确定了尼克酰胺氨基转移酶基因NAAT1的单碱基突变，使得剪接识别位点错误后导致转录本一个60bp外显子的缺失。3．对NAAT1酶（EC 2.6.1.80）催化反应途径的终产物脱氧麦根酸进行了测定，结果只在野生型的根际分泌物中检测到脱氧麦根酸，而在突变体中没有检测到该物质。进一步对尼克酰胺氨基转移酶的催化作用底物尼克酰胺（NA）进行测定，在3种条件下突变体中的尼克酰胺都大量积累。这些结果充分说明突变体中的铁吸收系统Ⅱ已被抑制。4．利用基因芯片技术对柠檬酸铁（citrate-Fe）、螯合铁（ED）TA-Fe)和缺铁3种营养条件下突变休与野生型的基因表达差异进行分析。在citrate-Fe条件下，突变体中系统Ⅱ中NA和DMA合成基因、金属吸收及转运的基因以及一些转录因子的表达都被显著增强，1个酸性磷酸酶基因在突变体根中的表达也增强。这些基因大多与缺铁胁迫响应相关，所以相对于野生型而言，突变体中这些基因的增强表达显示出突变体中受到了缺铁的胁迫。EDTA-Fe的条件下，上述的这些基因在突变体的根中仍然表达增强，而突变体中铁蛋白ferritin基因的表达则有所下降。这些结果表明，由于NAAT1基因的突变，突变体内铁的代谢及响应途径受到影响，导致NA合成途径的基因以及与金属离子吸收有关的基因被增强表达。上述研究结果表明，水稻中铁吸收系统Ⅱ的抑制可以增强铁、锌元素吸收，这为我们发展微显元素吸收增强品种的分子设计提供了参考依据。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1.植物有两种铁吸收的系统
• 1.1 植物铁吸收的系统Ⅰ
• 1.2 植物铁吸收的系统Ⅱ
• 2.植物中铁转运的研究
• 2.1 铁的长距离运输
• 2.2 铁转运体基因
• 2.2.1 YSL转运体
• 2.2.2 ZIP转运体
• 2.2.3 NRAMP转运体
• 3.铁的主要生理功能
• 3.1 铁参与了许多氧化还原反应
• 3.2 植物铁蛋白
• 4.缺铁胁迫下的基因表达与调控
• 4.1 bHLH转录因子响应缺铁胁迫
• 4.2 FRD3及其它基因的缺铁响应
• 5.基因芯片技术及在植物研究中的应用
• 5.1 基因芯片技术概论
• 5.2 Affymetrix基因芯片技术及应用
• 5.2.1 Affymetrix基因芯片的特点
• 5.2.2 Affymatrix基因芯片在植物中的应用研究
• 6.论文的研究内容和研究目的
• 第二章 突变体std的表型与元素分析
• 1.材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 水稻生长条件
• 1.2.2 水稻营养液的配制
• 1.2.3 植株生长参数的测定
• 1.2.4 铁、锌元素的测定
• 2.结果与分析
• 2.1 突变体的筛选与幼苗生长分析
• 2.2 在不同铁营养条件下突变体的生长表现
• 2.3 不同条件下突变体和野生型植株内铁、锌元素的变化
• 2.4 突变体的秸秆和谷粒中铁、锌元素的变化
• 3.讨论
• 3.1 突变体std的症状与铁营养有关
• 3.2 突变体std并未丧失吸收铁的能力
• 第三章 突变体std的基因定位与克隆分析
• 1.材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试验方法
• 2群体的构建及遗传分析'>1.2.1 F₂群体的构建及遗传分析
• 1.2.2 SSR分析方法
• 1.2.3 基因定位
• 1.2.4 基因克隆与测序分析
• 1.2.5 基因结构与编码蛋白的分析
• 1.2.6 RNA提取及反转录
• 1.2.7 原核蛋白表达分析
• 2.结果与分析
• 2.1 突变体的遗传分析
• 2.2 基因定位
• 2.3 候选基因的分析
• 2.4 NAAT蛋白的同源与进化分析
• 3.小结
• 第四章 脱氧麦根酸与尼克酰胺的含量分析
• 1.材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 水稻生长条件
• 1.2.2 脱氧麦根酸（DMA）的测定
• 1.2.3 尼克酰胺（NA）的测定
• 2.结果与分析
• 2.1 脱氧麦根酸分泌量的变化
• 2.2 尼克酰胺（NA）含量的变化
• 3.讨论
• 3.1 脱氧麦根酸的缺乏致使突变体铁吸收系统Ⅱ缺陷
• 3.2 螯合态的铁营养可替代缺失的脱氧麦根酸-铁
• 3.3 水稻中铁吸收系统Ⅱ缺陷引起了NA的大量增多
• 第五章 突变体std的基因表达分析
• 1.材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 试验处理类型
• 1.2.2 RNA的提取和纯化
• 1.2.3 cDNA的合成和纯化
• 1.2.4 cRNA的合成、纯化及片段化
• 1.2.5 芯片杂交与扫描
• 1.2.6 芯片数据分析
• 1.2.7 芯片数据的聚类分析
• 1.2.8 半定量RT-PCR分析
• 2.结果与分析
• 2.1 脱氧麦根酸合成途径中关键基因的表达变化
• 2.2 转运体基因的表达变化
• 2.3 转录因子和其它基因的表达变化
• 3.讨论
• 3.1 NA合酶基因的增强表达导致突变体中NA大量积累
• 3.2 离子吸收转运的增强对突变体中铁、锌的增多起着作用
• 3.3 突变体中铁代谢过程的信号转导和表达调控
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的科研论文