樱桃番茄的HBsAg基因转化及其突变体特性研究

论文摘要

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染会导致全世界每年有上百万的人死于肝癌或肝硬化。当前预防乙肝有效的措施是采用乙肝疫苗。目前乙肝病毒基因工程疫苗主要以酵母为载体进行生产。随着转基因植物口服疫苗的发展,编码乙肝病毒抗原的目的基因被整合到植物基因组中。樱桃番茄（Lycopersicon esculentum var. cerasiforme）是普通番茄的一个亚变种,是茄科番茄属的一年生或多年生的草本植物。其营养丰富,可以生食。本研究构建了一个携带有乙肝病毒表面抗原（HBV surface antigen, HBsAg）基因的植物表达载体,并通过农杆菌介导转化樱桃番茄。在转化过程中,意外获得一株转基因三倍体突变体。由于转基因植物的大田种植和推广应用可能存在一定的风险,因而在进行基因转化的基础研究过程中,后续研究进而转为对该三倍体突变体的生长特性（包括生理生化、抗性以及形态发生特性等方面）进行研究。1植物表达载体的构建与樱桃番茄的转化成功构建了含有adr亚型HBsAg S基因的植物表达载体pCAMBIA1301/HB,并获得了表达HBsAg S基因的转基因樱桃番茄植株。PCR鉴定和Southern杂交检测结果表明,HBsAg S基因已经整合到转化的樱桃番茄基因组中。HBsAg蛋白在转基因樱桃番茄植株中的表达量分别为100.36ng/g叶片鲜重和127.54ng/g果实鲜重。该部分内容已在vaccine2010 vol.28 No.46发表。2温室栽培转基因樱桃番茄突变体的生理生化特性分析通过Hyg（潮霉素）筛选、PCR鉴定、Southern blotting检测和流式细胞分析,获得了一株HBsAg转基因樱桃番茄突变体,该转基因樱桃番茄突变体为三倍体,长势良好,但种子败育。本试验对温室栽培的转基因樱桃番茄突变体生理生化特性进行了详细的评价。结果表明,经PCR鉴定, HBsAg基因仍然稳定表达在温室栽培的转基因樱桃番茄突变体基因组中。流式细胞仪分析结果表明,该突变体是三倍体。与非转化樱桃番茄相比,温室栽培转基因突变体表现出较高的叶绿素含量和蛋白质含量、较好的保水能力和膜渗透性、以及较强的抗氧化酶活性。该研究结果已被Russian journal of genetics接收,将于2011 vo1.47 No.8发表。3转基因樱桃番茄突变体愈伤组织对盐胁迫的生理响应盐度是影响植株生长的重要因素。研究转基因植物在盐胁迫逆境条件下的生理响应,可以明确转基因植物在生长和发育过程中的抗盐性和抗逆性。鉴于转基因樱桃番茄突变体在温室栽培过程中有较强的抗性,本试验以HBsAg转基因樱桃番茄突变体愈伤组织为试验材料,研究了其在不同盐浓度下的生理生化变化。结果表明：1) NaCl处理转基因樱桃番茄突变体愈伤组织时,盐的半致死浓度为80mmol/L。转基因樱桃番茄突变体愈伤组织耐盐的阈值大约在60mmol/L-100mmol/L。2)盐胁迫下,随着NaCl浓度梯度的增加,突变体愈伤组织的SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）、CAT（过氧化氢酶）和APX（抗坏血酸过氧化物酶）活性呈先升高后降低的趋势。在盐浓度大于40mmol/L时,各酶活性开始受到盐胁迫的影响,但CAT活性变化较小。相同盐浓度胁迫下,突变体愈伤组织各酶活性均明显高于非转基因樱桃番茄,表明突变体愈伤组织耐盐性较强。3)NaCl胁迫下,突变体愈伤组织的H202（过氧化氢）含量、MDA（丙二醛）含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量和电导率均随NaCl处理浓度的增加而持续升高。但在相同NaCl浓度胁迫下,与非转基因樱桃番茄愈伤组织相比,突变体愈伤组织的H202含量、MDA含量和电导率较低,可溶性糖含量和脯氨酸含量较高,表明突变体的抗逆性较强。4)随着盐胁迫的加重,突变体愈伤组织叶绿素含量均有下降趋势。且在相同处理浓度下,突变体愈伤组织中的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量均高于非转基因樱桃番茄愈伤组织。表明在盐胁迫条件下突变体愈伤组织的光合作用较强。以上结果表明,转基因樱桃番茄突变体愈伤组织的耐盐性明显提高,与SOD、POD和APX活性变化以及可溶性糖含量的积累密切相关。4转基因樱桃番茄突变体组培苗对盐胁迫的生理响应本试验以HBsAg转基因樱桃番茄突变体组培苗为试验材料,分析了其在不同盐浓度下的生理生化变化,旨在为突变体温室栽培的抗性研究提供前期理论基础。研究结果表明：1) NaCl处理转基因樱桃番茄突变体组培苗的过程中,盐的半致死浓度为150mmol/L。转基因樱桃番茄突变体组培苗耐盐的阈值大约在100mmol/L-200mmol/L。2)盐胁迫下,突变体组培苗SOD、POD、CAT、APX活性和脯氨酸含量随着NaCl浓度的增大呈先升高后降低的趋势。在盐浓度大于60mmol/L时,各抗氧化酶活性开始受到盐胁迫的影响。在100mmol/LNaCl浓度胁迫下,脯氨酸的积累量达到顶峰。相同盐浓度胁迫下,突变体组培苗各酶活性以及脯氨酸含量均高于非转基因樱桃番茄。3)随着NaCl浓度逐渐增大,突变体组培苗的H202含量、MDA含量、可溶性糖含量和电导率均随NaCl处理浓度的增大而大幅度增加。但在相同NaCl浓度胁迫下,突变体组培苗的H202含量、MDA含量和细胞膜渗透性均低于非转基因樱桃番茄。4)盐胁迫处理明显降低了各组培苗的叶绿素含量,总体上随着胁迫强度的加剧,叶绿素含量呈下降趋势。在同一盐浓度处理下,突变体组培苗的叶绿素a、b含量及总叶绿素含量均高于非转基因樱桃番茄组培苗,表明突变体的光合作用较强。以上结果表明,SOD和APX活性的变化、可溶性糖和脯氨酸的积累以及叶绿素含量的变化与转基因樱桃番茄突变体组培苗的耐盐性较强有关。5转基因樱桃番茄突变体发育过程中的形态结构变异基于转基因樱桃番茄突变体的倍性、生理生化特性以及抗性都发生明显的变化,本研究从胚胎学角度研究其变异特性。以相同培养条件下的非转化樱桃番茄和转基因樱桃番茄突变体叶片为试验材料进行愈伤诱导,通过石蜡切片技术和电子显微镜技术观察了其在外植体分化和愈伤发育过程中形态发生的变化特征。组织学分析表明,培养21d时,在突变体愈伤组织块的腋生部位出现不定芽原基,进而发育成不定芽。培养35d时,同时出现各种类型的胚状体。表明转基因樱桃番茄突变体在再生过程中,同时出现器官发生和体细胞胚发生两种途径,且以器官发生为主；非转基因樱桃番茄只通过一种形态发生途径即体细胞胚发生进行再生。进一步通过扫描电镜和透射电镜观察其细胞超微结构变化。结果表明,与非转基因樱桃番茄相比,突变体愈伤组织细胞在发育的各个阶段,一些细胞器的形态和数量（如高尔基体、线粒体、叶绿体等）有明显的变异。进一步证明转基因樱桃番茄突变体在形态建成和器官发育的过程中出现变异。该部分研究结果将于《电子显微学报》2011年vo1.30 No.2发表。6转基因樱桃番茄突变体发育过程中的生理生化变化生理生化变化是形态发生的基础。本研究以转基因樱桃番茄突变体叶片外植体器官发生和体细胞胚发生的诱导为基础进行组织培养,研究了突变体叶片再生过程中外植体抗氧化酶活性和某些生理参数（生长量、可溶性蛋白质含量、叶绿素含量、抗氧化酶活性以及IAA氧化酶活性等）的变化趋势。结果表明：樱桃番茄转基因突变体在器官发生和体细胞胚发生过程中抗氧化酶活性有明显的变化。在培养初期SOD活性逐渐增高,在培养21d时达到最大活性,此后其活性缓慢降低。POD活性在整个发育过程中呈下降趋势。CAT活性整体呈上升趋势,但变化幅度较小。IAAO（吲哚乙酸氧化酶）活性在培养42d前表现为缓慢的上升趋势,并在42d活性最高。表明SOD和POD活性与器官发生的早期事件密切相关。IAAO活性与芽的形成有关。突变体的愈伤增长率在培养21-28d时快速降低,在28d后又表现为快速的增长趋势。该现象的出现是由于突变体在愈伤分化期间,首先出现了器官发生方式所致。突变体愈伤组织的可溶性蛋白质含量在整个发育过程中变化趋势与非转基因樱桃番茄相似,但发生变化的时期不同。表明可溶性蛋白质含量与器官发生密切相关。该部分研究结果已被《核农学报》录用,将于2011 vol.25 No.3发表。综上所述,本研究成功地进行了HBsAg/adr基因在樱桃番茄中的表达,并获得一株转基因突变体。研究表明,该突变体的倍性、生理生化特性、抗性以及形态发生途径都发生了明显的变异。

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英文缩略词

中文摘要

Abstract

第一篇乙肝表面抗原基因在樱桃番茄中的转化及其表达

第一章文献综述

第一节乙肝病毒表面抗原（HBsAg）在转基因植物中的表达研究进展

1 引言

2 乙肝表面抗原（HBsAg）基因的分子生物学及其功能

3 目标基因和表达载体的选择

3.1 目标基因的选择

3.2 表达载体的选择

4 HBsAg转基因植物表达体系

4.1 HBsAg基因在转基因植物中的稳定表达

4.2 HBsAg基因在转基因植物中的暂态表达

5 HBsAg在转基因植物中的表达水平

6 其它乙肝抗原在转基因植物中的表达

7 基于植物的HBsAg免疫原性研究和临床试验

8 当前存在问题和展望

第二节本研究目的和意义

第二章植物表达载体的构建与樱桃番茄的转化

1 试验材料和试验试剂

1.1 试验材料

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4 基本培养基

2 试验方法

2.1 植物表达载体的构建

2.2 根癌农杆菌LBA4404感受态制备

2.3 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的转化

2.4 根癌农杆菌质粒的提取和鉴定

2.5 樱桃番茄无菌苗的获得

2.6 樱桃番茄外植体的转化

2.7 转化植株的DNA提取和PCR鉴定

2.8 转化植株的Southern杂交

2.9 ELISA检测

3 结果与分析

3.1 根癌农杆菌质粒pCAMBIA1301/HB的构建和转化

3.2 转化植株的PCR鉴定和Southern杂交检测

3.3 ELISA分析

4 讨论

5 结论

第二篇 HBsAg转基因樱桃番茄突变体特性研究

第一章文献综述

第一节番茄突变体研究进展

1 植物突变体来源途径

1.1 自然突变

1.2 人工诱变

1.3 插入突变

2 番茄突变体研究进展

2.1 自然突变在番茄突变体研究中的应用

2.2 物理诱变和化学诱变在番茄突变体研究中的应用

2.3 插入突变在番茄突变体研究中的应用

第二节植物组织培养与形态发生

1 植物组织培养形态发生的基本理论

2 形态发生的遗传学理论

2.1 体细胞胚发生的遗传学理论

2.2 芽器官发生的遗传学理论

2.3 根器官发生的遗传学理论

2.4 花器官发生的遗传学理论

3 植物组织培养的技术创新

3.1 气态或物理环境的操作

3.2 薄细胞层和合成种子技术

4 结论和展望

第三节盐胁迫下植物抗性机制研究进展

1 植物对盐胁迫的反应

1.1 盐胁迫对植物形态的影响

1.2 盐胁迫对植物生理生化特性的影响

2 利用组织培养研究植物耐盐机理与筛选耐盐突变体

3 利用基因转化研究植物抗盐性

4 耐盐突变体鉴定

5 番茄耐盐性研究进展

5.1 番茄耐盐生理研究

5.2 转基因耐盐番茄的研究进展

第四节本研究目的和意义

第二章温室栽培转基因樱桃番茄突变体生理生化特性研究

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验试剂和仪器

1.3 试验方法

2 结果与分析

2.1 温室栽培转基因樱桃番茄突变体的PCR鉴定

2.2 温室栽培转基因樱桃番茄突变体的倍性分析

2.3 温室栽培转基因樱桃番茄突变体的生理生化特性

3 讨论

4 结论

第三章转基因樱桃番茄突变体愈伤组织对盐胁迫的生理响应

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验试剂和仪器

1.3 试验方法

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对转基因樱桃番茄突变体愈伤组织生长的影响

2.2 不同浓度NaCl胁迫对转基因樱桃番茄突变体愈伤组织抗氧化酶活性的影响

2.3 不同浓度NaCl胁迫对转基因樱桃番茄突变体愈伤组织某些生理参数的影响

3 讨论

4 结论

第四章转基因樱桃番茄突变体组培苗对盐胁迫的生理响应

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验试剂和仪器

1.3 试验方法

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对转基因樱桃番茄突变体组培苗生长的影响

2.2 不同浓度NaCl胁迫对转基因樱桃番茄突变体组培苗抗氧化酶活性的影响

2.3 不同浓度NaCl胁迫对转基因樱桃番茄突变体组培苗某些生理参数的影响

3 讨论

4 结论

第五章转基因樱桃番茄突变体发育过程中的形态结构变异

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验试剂和仪器

1.3 试验方法

2 结果与分析

2.1 转基因樱桃番茄突变体形态发生过程中的显微结构变化

2.2 转基因樱桃番茄突变体形态发生过程中的超微结构变化

3 讨论

4 结论

第六章转基因樱桃番茄突变体发育过程中的生理生化变化

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验试剂和仪器

1.3 试验方法

2 结果与分析

2.1 转基因樱桃番茄突变体在器官发生和体细胞胚发生过程中抗氧化酶活性的变化

2.2 转基因樱桃番茄突变体在器官发生和体细胞胚发生过程中某些生理参数的变化

3 讨论

4 结论

第三篇全文总结

第一节本研究创新点

第二节本研究结论

第三节下一步研究工作

参考文献

图版说明

Explanation of plates

图版

攻读博士学位期间取得的科研成果

攻读博士学位期间参与的主要科研项目

致谢

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樱桃番茄的HBsAg基因转化及其突变体特性研究

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