论文摘要
目的：研究小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对白血病K562／ADM多药耐药细胞mdr1基因及其表达产物P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表达和功能的影响以及耐药性的逆转效应，探讨siRNA逆转白血病细胞多药耐药性的可能机制。方法：选择K562／ADM细胞作为研究靶细胞，针对mdr1基因mRNA不同靶点设计合成4对含有21个碱基的siRNA（si-mdr1／333、si-mdr1／764、si-mdr1／1074和si-mdr1／2832）及阴性对照siRNA分子，脂质体介导转染K562／ADM细胞，实时荧光定量PCR和RT-PCR检测mdr1基因mRNA的表达；流式细胞仪（FCM）测定P-gp蛋白表达水平及功能、线粒体膜电位（△ψm）和Caspase-3活性；RT-PCR检测caspase-3和caspase-9基因mRNA的表达；Annexin V／PI双标记法检测K562／ADM细胞凋亡，MTT比色法检测K562／ADM细胞对阿霉素（ADM）、柔红霉素（DNR）和足叶乙甙（Vp16）的敏感性。结果：筛选针对mdr1 mRNA的4个靶点设计合成的siRNA分子，其中针对333靶点的siRNA（si-mdr1／333）对mdr1基因的表达具有较好的沉默效果，RT-PCR和实时荧光定量PCR检测，mdr1 mRNA表达分别降低69％和63％；P-gp合成明显降低，72h时P-gp表达阳性率降低，由95.6％降低至62.3％，平均荧光强度（MFI）由2.52降低至1.99，同时P-gp的外排功能受抑，细胞内ADM含量显著增高，阳性率由50.6％升高至93.6％。经si-mdr1／333（200nmol／L）作用48h，RT-PCR和FCM检测证实caspase-3和caspase-9基因mRNA的表达均无明显变化，但Caspase-3活性显著增强，活化Caspase-3由对照的0.84％增高至14.5％。K562／ADM细胞经200 nmol／Lsi-mdr1／333作用48h后线粒体跨膜电位（△ψm）无明显变化。si-mdr1／333可显著提高K562／ADM细胞对ADM、DNR和Vp16的敏感性，耐药逆转倍数分别为3.45、1.70和2.91倍。Annexin V／PI双染色显示si-mdr1／333处理后，经低浓度Vp16（40μmol／L）诱导24h，K562／ADM凋亡细胞明显增高，细胞凋亡率由2.32％（对照）增高至14.42％（siRNA+Vp16）。结论：siRNA特异性地阻抑白血病多耐药细胞K562／ADM细胞mdr1基因及其产物P-gp的表达，提高其对常规抗癌药物的敏感性，其机制为siRNA通过阻断mdr1基因的表达，减轻P-gp对Caspase-3活性的抑制效应，逆转K562／ADM细胞P-gp高表达介导的多药耐药性和凋亡抑制。