论文摘要
脑缺血,中医称为“中风”或“脑卒中”,是一个复杂的病理级联反应机制,其核心问题是神经元损害引起的神经功能障碍,因此,对脑缺血脑神经保护的治疗就很必要。中医的整体观、中药的复杂性和作用机制的多样性,使其在脑缺血损伤的神经保护治疗上独具优势。很多治疗脑缺血中药制剂在临床上疗效肯定,但由于缺乏更深入研究,药效物质基础尚未明确。目前在中药及天然药脑神经保护药物研究中,由于筛选的活性成分生物利用度低,尤其难透过血脑屏障,所以难以应用于临床。因此本文从现有制剂入手,提出了“中药及其制剂→脑神经保护+透过血脑屏障→中药脑靶向神经保护药效物质基础”的研究思路。灯盏细辛来源于菊科飞蓬属植物短葶飞蓬（Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz.）,始载于《滇南本草》,其记载有:“左瘫右痪,水煎点水酒服。”灯盏细辛药材、灯盏细辛注射液现已收载于《中华人民共和国药典》（2005年版·一部）。由于灯盏细辛对心脑血管疾病临床治疗上的优势,灯盏细辛注射液、灯盏花素注射液、灯盏花素片等制剂已广泛应用于临床。灯盏细辛治疗脑缺血、中风后遗症等缺血性脑血管病的研究,主要是从改善血液流变性、缺血再灌注损伤的保护、抗脑血栓等方面进行,而其脑神经保护与及透血脑屏障药效物质基础尚不明确。目的:本文从临床制剂有效性出发,从药物成分透血脑屏障与脑神经保护作用入手,研究灯盏细辛治疗脑缺血脑靶向神经保护药效物质基础。方法:1.采用HPLC法建立了灯盏细辛不同制剂的HPLC指纹图谱研究;采用毛细管电泳-间接化学发光联用（CE-CL）方法,进行了灯盏细辛注射液抗氧化作用有效组分的指纹图谱研究。2.采用正反相硅胶、聚酰胺柱色谱和制备HPLC等现代提取分离方法对灯盏细辛进行了系统的提取分离,采用1H-NMR、13C-NMR、MS等波谱技术进行结构鉴定。同时采用酯化和酰化对咖啡酸和野黄芩苷进行了结构修饰。3.采用体外培养大鼠大脑皮层神经细胞,MTT法测定细胞存活率,评价灯盏细辛制剂脑神经保护活性,并筛选灯盏细辛脑神经保护有效成分。4.采用体外共培养原代大鼠脑微血管内皮细胞（BMVEC）和星型胶质细胞（AC）,建立体外血脑屏障模型（BBBM）,采用HPLC检测透血脑屏障有效成分。结果:1.灯盏细辛制剂主要化学组分为野黄芩苷、咖啡酸、二咖啡酰奎宁酸等黄酮和咖啡酰类成分,灯盏细辛注射液中有野黄芩苷等四个抗氧化作用有效组分。2.分离出12个化合物,鉴定了其中9个化合物的结构,分别是:野黄芩苷、野黄芩素、芹菜素、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸、1,5-咖啡酰奎宁酸、3,4-咖啡酰奎宁酸、木栓酮、豆甾醇、正十四脂肪酸。结构修饰,得到咖啡酸甲酯、咖啡酸乙酯、3,4-二乙酰基咖啡酸、野黄芩素、野黄芩苷乙酯五种衍生物。3.灯盏细辛注射液、灯盏花素注射液等制剂具有促进大脑皮层神经细胞存活的作用;灯盏细辛中主要化学成分野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸等黄酮类成分,以及咖啡酸、二咖啡酰奎宁酸类成分也促进大脑皮层神经细胞存活的作用。咖啡酸和野黄芩苷的结构修饰后衍生物均有一定的脑神经保护作用。4.1,5-DCQ、3,5-DCQ、3,4-DCQ、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸,均可不同程度透过BBBM。咖啡酸和野黄芩苷的结构修饰后产物中,咖啡酸甲酯、3,4-二乙酰基咖啡酸、野黄芩苷乙酯可透过BBBM。结论:1.灯盏细辛及其制剂中主要含有黄酮和咖啡酰类成分,灯盏细辛注射液、灯盏花素注射液等制剂具有脑神经保护作用;灯盏细辛中主要脑神经保护的有效成分为野黄芩苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸等黄酮类成分,以及咖啡酸、二咖啡酰奎宁酸类成分。灯盏细辛中野黄芩苷的神经保护作用可能与其清除氧自由基有关。2.1,5-DCQ、3,5-DCQ、3,4-DCQ、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸,均可不同程度透过BBBM,它们为灯盏细辛脑靶向神经保护药效物质基础。3.咖啡酸和野黄芩苷结构修饰后产物,均由亲水性变为亲脂性,油水分配系数提高了约103-105倍,其中咖啡酸甲酯、3,4-二乙酰基咖啡酸、野黄芩苷乙酯均为脑靶向神经保护有效成分。创新点:1.本文基本建立从现有临床确有疗效中药制剂出发,进行“中药及其制剂→脑神经保护+透过血脑屏障→中药脑靶向神经保护药效物质基础”的新模式。2.采用体外共培养BBBM和大脑皮层神经细胞培养,基本阐明灯盏细辛透血脑屏障神经保护有效成分。