论文摘要
β细胞功能衰竭是2型糖尿病晚期一个重要的特征,高糖诱导的细胞凋亡是导致胰岛β细胞功能衰竭的主要原因之一。研究高糖诱导的胰岛β细胞凋亡的分子机制对阐明2型糖尿病的发生和发展,以及对糖尿病的防治都具有重要的意义。Tribbles同源蛋白3（tribbles homolog 3,TRB3）是新发现的一种具有广泛生物学功能的基因。TRB3可以和AKT/PKB（protein kinsase B）结合抑制胰岛素信号通路,参与胰岛素抵抗的发生;通过ATF4/CHOP（activating transcriptionfactor 4/CCAAT/enhancer binding proteins homologus protein）通路参与细胞应激反应的调控。目前TRB3基因是否参与高糖诱导的胰岛β细胞凋亡的研究尚未见文献报道。目的:研究高糖条件下TRB3基因的表达情况,以及TRB3基因过表达对高糖诱导的胰岛β细胞凋亡的影响和可能涉及的分子机制。方法:应用实时定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,real-timePCR）检测糖尿病GK大鼠（Goto-Kakizaki Wistar rat,GK rat）胰岛细胞和高糖刺激的INS-1细胞中TRB3基因mRNA的表达。应用Tet-on系统将TRB3质粒转染到INS-rβ（r9）细胞内,构建可诱导TRB3基因表达的β细胞系。采用real-time PCR和细胞免疫荧光方法证实所构建的β细胞TRB3基因的可诱导性。应用免疫蛋白印记（Western Blot）分析强力土霉素（doxycycline,DOX）诱导β细胞TRB3基因表达的量-效和时-效关系。应用酶联免疫吸附分析（enzymelinked immuneosorbent assay,EILSA）和MTT法分别检测TRB3基因过表达对β细胞胰岛素分泌和细胞增殖的影响。应用DNA片段化、TUNEL、Annexin V/PI流式细胞仪分析高糖条件下TRB3过表达对β细胞凋亡的影响,以及RNA干扰TRB3基因表达对β细胞凋亡的调节作用。应用激光共聚焦显微镜观察TRB3基因过表达的β细胞线粒体形态和细胞色素C分布。应用Western Blot和ELISA分别检测细胞色素C含量和capase-3活性。应用流式细胞术检测TRB3基因过表达对β细胞线粒体膜电位（membrane potential,Δψm）和反应性活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生的影响。结果:糖尿病GK大鼠胰岛细胞中TRB3 mRNA的表达较正常对照组明显升高,高糖可以明显上调INS-1细胞中TRB3基因mRNA的表达。采用Tet-on系统,我们建立了TRB3基因可诱导的β细胞系。DOX可以诱导TRB3基因在此细胞系中的表达,并表现明显的量-效和时-效关系。在高糖条件下,TRB3基因过表达可以抑制β细胞的增殖并减少胰岛素的分泌。采用DNA片段法,TUNEL染色和流式细胞分析都证实,TRB3基因过表达明显促进高糖引起的β细胞凋亡。采用siRNA干扰技术抑制TRB3基因在β细胞内的表达,则可明显降低高糖诱导的β细胞凋亡。激光共聚焦显微镜观察发现,TRB3基因过表达的β细胞的线粒体形态发生变化,细胞色素C的分布出现异常。Western Blot显示细胞色素C释放增加。ELISA检测发现,TRB3过表达的β细胞中Caspase-3的活性升高。流式细胞仪分析显示,TRB3过表达促进β细胞线粒体Δψm下降和ROS含量增加。以上结果提示,这些因素可能与TRB3基因参与高糖诱导胰岛β细胞凋亡的机制相关。结论:TRB3基因参与高糖诱导的胰岛β细胞凋亡。