三种水稻病毒基因沉默抑制子的鉴定和研究

论文摘要

在植物及多种真核生物中,基因沉默是一种保守的抗病毒机制。为对付这种防御机制,大多数植物病毒及一些动物病毒编码一或多个基因沉默抑制子。水稻是我国最重要的粮食作物之一。病毒病一直是威胁水稻生产的一个重要因素。近年来,水稻锯齿叶矮缩病毒（Rice ragged stunt virus, RRSV）和南方黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV）的流行给我国水稻生产造成了严重损失。本实验克隆了RRSV和SRBSDV两种病毒非结构蛋白全长ORF,并分别将它们连接到pPZP212或pEarleyGate 100载体,将所得质粒分别转化到农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ） EHA105,然后分别与携带有35S-GFP的农杆菌混合,注射本氏烟16c。在注射后第3天,所有注射区域均出现了较强的绿色荧光。但只有在共注射35S-RRSVS6加35S-GFP或35S-SRBSDVS6加35S-GFP的区域中,荧光强度一直持续到第7天。另外,在共表达RRSV S6突变体加35S-GFP的区域中,荧光强度从第3天开始出现下降,到第7天基本消失。在注射后第7天,GFP的mRNA在共表达RRSV的Pns6和35S-GFP的区域中大量积累,而此时,在这些区域中,GFP对应的siRNA基本检测不到。把RRSV的Pns6连接到马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）上后,该蛋白能显著增强PVX的致病性。从这些结果中,本实验推断RRSV和SRBSDV的Pns6具有基因沉默抑制子活性。进一步的分析表明RRSV的Pns6不能抑制由双链GFP诱导的沉默。并且,在缺失一段对核酸结合必须的区域后,Pns6不再具有抑制子活性。在本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片表皮细胞中表达时,RRSV的Pns6主要定位于细胞周围,并形成一些可区分的小点。本实验室已有研究结果表明RRSV的Pns6可能为一运动蛋白。Pns6的多功能性促使我们以其为诱饵,运用酵母双杂交实验进行了水稻cDNA文库的筛选。对经过筛选而得到的阳性克隆,本实验进行了测序,序列分析表明,至少有44个水稻蛋白可能与RRSV的Pns6存在着互作。本实验对这些蛋白按GO注释进行了分类,结果表明这些蛋白在功能上具有着很大的多样性。本实验室先前的研究表明,水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）的p2可以与水稻的SGS3 （OsSGS3）互作。并且在RSV侵染的水稻中,5个可以被TAS3产生的反式作用小干扰RNA识别的生长素响应因子基因在表达上出现了上调,这表明RSV的侵染可能影响了水稻的反式作用小干扰RNA途径。本实验开展了一些旨在进一步了解p2与OsSGS3互作的生物学意义的研究,并得到以下结果:1)RSV的p2是一基因沉默抑制子,它能抑制由单链GFP诱导的基因沉默并能显著增强PVX的致病性。2)在RSV侵染的水稻中,生长素相关基因并没有发生一致的上调,这表明在本实验室先前的研究中,反式作用小RNA靶标基因上调是特异的。3)p2缺失N端的40个氨基酸后,仍能和OsSGS3互作,但缺失了C端20个氨基酸的p2不能和OsSGS3互作。4)本实验制备了OsSGS3的多克隆抗体。5)本实验构建了过表达OsSGS3的转基因水稻植株,单管单苗接种实验表明,与野生型水稻比,过表达OsSGS3的转基因水稻对RSV表现出较强的抗性。这些结果对我们进一步认识RSV与水稻的互作有着重要的意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 基因沉默概述
• 1.2 植物基因沉默作为一种抗病毒机制
• 1.2.1 植物抗病毒基因沉默的发现
• 1.2.2 植物抗病毒基因沉默的机制
• 1.3 植物病毒编码的基因沉默抑制子
• 1.3.1 基因沉默抑制子的鉴定方法
• 1.3.2 沉默抑制机制
• 1.3.3 基因沉默抑制子与病毒的致病性
• 1.4 水稻条纹病毒概述
• 1.5 水稻锯齿叶矮缩病毒
• 1.6 南方水稻黑条矮缩病毒
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 RRSV 和SRBSDV 的抑制子的鉴定和研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要方法
• 2 结果
• 2.1 RRSV/SRBSDV 的P1156 可以抑制由单链GFP 诱导的基因沉默
• 2.2 RRSV 的P1156 不能抑制由双链GFP 诱导的基因沉默
• 2.3 RRSV 的P1156 能增强PVX 的致病性
• 2.4 RRSV P1156 的细胞学定位研究
• 2.5 以RRSV P1156 为诱饵筛选水稻cDNA 文库
• 3 总结与讨论
• 3 RSV P2 与水稻SG53 互作的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要方法
• 2 结果
• 2.1 RSV 的p2 可以抑制由单链GFP 诱导的基因沉默
• 2.2 RSV 的p2 能增强PVX 的致病性
• 2.3 生长素相关基因的上调并不是水稻对RSV 侵染的一种一般性反应
• 2.4 酵母双杂交检测p2 与OsSG53 互作的关键区段
• 2.5 OsSG53 抗体的制备
• 2.6 过表达OsSG53 的转基因水稻植株的构建和抗病性测试
• 3 总结与讨论
• 参考文献
• 附录 1 酵母双杂交所鉴定的与RRSVPN56 互作的蛋白
• 附录 2 转基因所用各培养基配方
• 附录 3 博士生期间论文发表情况
• 致谢