论文摘要
大脑皮质神经元是大脑进行功能活动调节的基本单位,参与维持中枢神经系统内多种生理功能。大脑皮质神经元的树突和轴突通过突触联系形成局部环路,在接收外周信息的传入中发挥重要的功能。树突和轴突形态、分枝数量和延伸方向的改变会影响大脑皮质的发育,造成皮质功能的混乱,进而引起机体生理功能发生改变。影响树突和轴突的细胞和分子信号有很多,如Septin7等。溴结构域包含蛋白2（Bromodomain containing protein 2, BRD2）是一种保守的溴结构包含蛋白,其可以调控基因表达,在细胞增殖中发挥重要作用。功能研究发现BRD2在胚胎发育过程中发挥重要作用,但是目前尚无关于BRD2在大脑皮质发育过程中发挥作用的研究报道。基因转染是研究皮质神经元的重要方法,但传统的磷酸钙沉淀法和脂质体转染法在神经元内的转染效率较低,适用于形态学的观察,不适用于分子生物学水平的观察,而电穿孔转染法转率较高,适用于分子生物学水平的研究。本研究首先进行皮质神经元的分离,同时优化电穿孔转染条件,进而研究BRD2对大脑皮质神经元的调控机制。本研究包含以下两个方面的实验:1、小鼠大脑皮质神经元的分离和电穿孔转染条件的优化以出生24 h内的C57小鼠为研究工具,无菌条件下取双侧大脑皮质,进行皮质神经元的分离。进而利用BTX公司ECM830电转仪,设置不同的电压和脉冲时间,将带绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein ,GFP）的shNC质粒电转染入皮质神经元内,采用免疫荧光双重标记的方法,观察不同条件下的电转染效率。结果:恒定脉冲时间15 ms时,随着电压的升高,电转染效率逐渐升高,在250 v时,电转染效率最高达（25.28±2.39）%,之后随着电压的继续升高,电转染效率呈下降趋势;恒定电压200 v时,随着脉冲时间的延长,电转染效率表现出先升高后下降的趋势,在脉冲时间25 ms时,电转染效率最高（27.10±2.05）%;设定电压和脉冲时间双向调节进行电转染,显示在200 v/25 ms和250 v/15 ms的条件下质粒DNA的电转染效率较高,分别为（31.15±1.89）%和（29.10±1.93）%。结论:在皮质神经元的电转染过程中,选择合适的电压和脉冲时间是保证电转染效率的关键因素。在200 v/25 ms和250 v/15 ms的电转染条件下,小鼠大脑皮质神经元可获得最大转染效率,分别为（31.15±1.89）%和（29.10±1.93）%。通过本实验,优化电转染条件,建立高效的转染方法,可以为进一步进行分子生物学研究提供技术支持。2、BDR2对大脑皮质神经元突起的发育调控以出生24 h内的C57小鼠为研究工具,无菌条件对大脑皮质神经元进行分离、培养,分别采用电穿孔方法和脂质体转染的方法将带GFP的BRD2 RNAi质粒和shNC质粒电转染入皮质神经元内,进而借助Real-Time PCR技术研究神经元中BRD2 mRNA和Septin7 mRNA的表达变化,同时应用免疫荧光双重标记技术,观察BRD2对神经元突起的影响。结果:BRD2 RNAi质粒转入后,与shNC组相比,BRD2 mRNA的表达明显下调（P<0.05）;免疫荧光双重标记后,观察树突和轴突分枝情况,计算树突和轴突的总长度,发现与对照组相比,BRD2 RNAi转染组的神经元树突和轴突分枝数量明显增多（P<0.05）,树突和轴突的总长度明显增长（P<0.01）。BRD2 RNAi抑制细胞内BRD2 mRNA的表达后,树突和轴突发育调控因子Septin7在神经元内的表达量明显升高,与对照组相比差异显著（P<0.05）。结论:本实验证实BRD2 RNAi质粒可以有效抑制皮质神经元中BRD2 mRNA的表达;BRD2对皮质神经元突起的生长发育具有抑制作用;该抑制作用可能与其上调下游分子Septin7的表达有关。但具体机制有待下一步研究进一步证实。