S100A1基因转导联合骨髓间充质干细胞移植治疗慢性心力衰竭大鼠的实验研究

论文摘要

背景与目的慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）已成为心血管疾病死亡的重要原因。心力衰竭的本质是心肌细胞数量的减少和分子机制异常。针对心肌细胞数量减少,移植能具有多向分化和自我增殖潜能的骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stemcells,MSCs）虽能改善CHF患者心脏功能,但是并不能解决心力衰竭的分子机制异常。现研究表明,CHF分子机制异常的关键是Ca2+转运异常,表现为Ca2+的摄入、释放、转运障碍。人们曾针对Ca2+摄入障碍增加肌浆网钙ATP酶（sarcoplasmic reticulumCa2+-ATPase,SERCA2a）表达,发现虽能增强心脏收缩功能,但会增加心肌梗死急性期死亡率、心律失常发生率。钙结合蛋白S100A1（calcium-binding protein S100A1）为调控SERCA2a的上游基因,通过对肌浆网钙SERCA2a、兰尼碱（ryanodine receptors 2,RyR2）受体的调控,调节心肌细胞Ca2+的释放、摄取、转运。CHF时S100A1蛋白表达下降,增加S100A1蛋白表达既能改善心脏功能,阻止心力衰竭的进展,又没有增加心律失常等副作用。MSCs与S100A1联合移植是否能达到既修复心肌细胞又调控衰竭心肌分子机制而达到改善心功能的相加效应,目前国内外均无报道。本研究拟通过观察对照组、MSCs移植组、S100A1转导组、MSCs与S100A1联合移植组心功能效应,探讨S100A1基因转导、S100A1基因转导联合MSCs移植在心力衰竭大鼠中的心功能效应。方法取6—8周龄雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠胫骨、股骨,收集骨髓腔冲洗悬液直接培养,经多次换液、传代,免疫组化法检测CD34、CD44表达情况。以超顺磁氧化铁和P3代MSCs共同孵育培养24h,普鲁士蓝染色评价标记效率,台盼蓝染色检验标记后细胞的活性。取8—10周龄SD大鼠50只,随机分至实验组（n=40）和假手术组（n=10）。以氯胺酮、速眠新Ⅱ大腿内侧肌肉注射复合麻醉,开胸后以置液氮内预冷10分钟的金属棒间断冷冻左心室游离壁3次,持续时间分别为15s,15s,10s。术后行心电图、超声心动图检查,取心脏组织行氯化三苯四氮唑（triphenyltetrazolium chloride,TTC）、苏木素-依红（hematoxylin-eosin,H&E）染色,观察心肌梗死面积、心功能变化,观察术中、术后大鼠存活率。在冷冻法建立的稳定慢性心力衰竭大鼠模型上,开胸后按分组分别将生理盐水、MSCs悬液、S100A1-AAV1/2病毒、S100A1-AAV1/2+MSCs混合物注射至大鼠心肌梗死灶周围。4周后用超声诊断仪测量心功能,取心脏组织行普鲁士蓝染色示踪移植的MSCs。结果全血贴壁法培养的大鼠MSCs贴壁、呈纤维细胞样生长,CD44阳性细胞比率为96%,不表达CD34。经SPIO标记后,普鲁士蓝染色标记效率为90%,标记后98%的细胞保持活性。冷冻术后4周实验组40只大鼠中35只两个或两个以上相邻导联Q波形成且＞1mv或V1、V3、V5导联R波之和＜10mv,超声心动图左室射血分数（left ventricular ejectionfraction,LVEF）46.55±6.80%,左室短轴缩短率（fractional shortening,FS）20.61±3.61%,TTC染色证实实验组左室梗死面积35.62±3.74%,HE染色示梗死区主要为疤痕组织,边界清晰。假手术组未见心肌梗死。实验组术后4周存活率达到87.5%。S100A1-AAV1/2+MSCs组、MSCs组心肌梗死灶边缘见普鲁士蓝染色阳性细胞,对照组未见任何阳性细胞。S100A1-AAV1/2+MSCs组、S100A1-AAV1/2组、MSCs组左室射血分数较治疗前分别增加15.41±6.75%（P＜0.01）、7.85±2.96%（P＜0.01）、5.63±2.60%（P＜0.01）,左室短轴缩短率较治疗前分别增高6.17±3.46%（P＜0.01）、3.02±1.25%（P＜0.01）、1.58±0.59%;左室射血分数、左室短轴缩短率增加值S100A1-AAV1/2+MSCs组与S100A1-AAV1/2组、MSCs相比有统计学差异（P＜0.05）。S100A1-AAV1/2+MSCs组、S100A1-AAV1/2组左室舒张末直径（left ventricular enddiastolic diameter,LVEDD）分别较治疗前减小1.87±0.64mm（P＜0.01）、1.00±0.62mm（P＜0.05）;左室舒张末直径减少值S100A1-AAV1/2+MSCs组与S100A1-AAV1/2组、MSCs相比有统计学差异（P＜0.01）。对照组左室射血分数、左室短轴缩短率较治疗前分别降低8.44±3.74%（P＜0.01）、4.64±1.37%（P＜0.01）,左室舒张末直径增大0.9±0.14mm（P＜0.01）。结论全血贴壁法能成功培养大鼠MSCs,SPIO可以安全、有效地标记MSCs,并能在体内示踪。采用金属棒冷冻法可成功建立大鼠急性心肌梗死后慢性心力衰竭模型,有效地提高术后大鼠存活率。以腺相关病毒为载体S100A1基因转导可以明显增强心力衰竭大鼠心脏功能,与MSCs联合可以进一步增加心力衰竭大鼠心脏功能,S100A1的过表达可以阻止心力衰竭的进展。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要缩略语表
• 前言
• 第一部分 骨髓间充质干细胞的培养和超顺磁氧化铁标记
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 冷冻法建立大鼠急性心肌梗死后慢性心力衰竭模型
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 S100A1基因转导联合骨髓间充质干细胞心肌内移植
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 附录:学习期间发表论文和参加科研工作情况
• 致谢