ALS抑制剂对固氮鱼腥藻的致毒效应与靶标酶ALS基因的表达及功能分析

论文摘要

本研究选择我国分布广、资源量大的有益固氮蓝藻藻种——固氮鱼腥藻（Anabaena azotica）和用量最大的磺酰脲类ALS抑制剂——苄嘧磺隆为研究对象，运用藻类生态毒理学、分子生物学、生物信息学以及计算机模拟等技术，开展了ALS抑制剂对固氮鱼腥藻的致毒效应与靶标酶ALS基因的表达及功能分析，获得了以下研究成果：1.苄嘧磺隆对固氮鱼腥藻的毒性研究通过不同剂量苄嘧磺隆对藻体生长效应、光合色素（叶绿素、藻胆素和类胡萝卜素）以及蛋白质的影响，建立苄嘧磺隆与藻类生长的剂量——效应关系，研究发现：1)有机溶剂丙酮对固氮鱼腥藻168h的NOEC值为0.1%；溶剂对藻体色素的组成成分没有影响，对干重影响表现出来的规律与对生长速率的影响一致。2)苄嘧磺隆对藻体生长效应、蛋白质含量以及光合色素影响显著，总体上呈现出低剂量刺激、高剂量抑制的Hormesis效应作用模式。3)光照变化对藻体生长影响显著，对其生长速率、细胞数、干重和蛋白质的改变明显。随着时间的延伸，光照与抑制剂苄嘧磺隆对藻体生长的交互作用影响显著。苄嘧磺隆对有益固氮鱼腥藻在一般使用浓度下存在致毒效应，而且这种致毒效应会随着光照的增强而增大。2. A. azotica ALS基因的克隆、表达研究建立了A. azotica ALS基因的PCR扩增体系，以pMD18-T simple载体和DH5α宿主菌对A. azotica ALS基因进行了克隆和测序分析；同时以pET28（a）+载体和BL21（DE3）对A. azotica ALS进行外源表达，构建表达载体pET-ALS，建立了A. azoticaALS酶外源表达体系。1)A. azotica ALS基因核苷酸序列全长1644bp，编码547个氨基酸残基，分子量为59.292kDa。2)通过IPTG诱导使目的蛋白A. azotica ALS得到了大量表达。通过不同浓度和时间的诱导优化表达条件，确定IPTG浓度为0.6mmol/L、诱导时间为5h时表达效果最好。3)以镍柱亲和层析进行重组蛋白包涵体的纯化，推断咪唑浓度在100mmol/L时洗脱纯化效果最佳。4)外源表达的固氮鱼腥藻ALS酶表现了较高的比活力，进一步证实了本体系外源表达A. azoticaALS酶的可行性。3. A. azotica ALS酶蛋白生物信息学研究A. azotica ALS基因序列与鱼腥藻PCC7120相似性达96.89%，氨基酸序列相似性达89.54%。A. azotica ALS基因具有完整的开放阅读框，其编码蛋白等电点为6.02，具有若干明显的疏水性区域，二级结构中α-螺旋占38.8%、β-折叠占43.5%、β-转角占10.4%，无规则卷曲则仅占7.68%，因氨基酸组成的差异，其二级结构与鱼腥藻PCC7120有些稍微的不同。通过Blastp分析、Mega4.0进行了A. azotica ALS的系统发育分析；通过蛋白结构功能域预测发现，A. azotica ALS属于硫胺素二磷酸依赖酶家族。通过SWISS-Model同源模建可见，A. azotica ALS蛋白三维结构与其它ALS晶体结构相似，每个单体由3个结构域组成，分别为α结构域（1163），β结构域（188325）和γ结构域（338526）。经质量评估、Procheck等检测，模型合理可信。4. A. azotica ALS活性部位及突变体研究研究探索了ALS活性部位的分子对接方法模型，推导出A.azotica ALS的活性部位和关键氨基酸残基，在预测出的11个pocket中，pocket7是A. azotica ALS的活性部位，而该部位的A381、G433、G434、D459、G461、G463、L464、Y530等氨基酸残基在A. azoticaALS催化过程中起着重要作用。推断出A. azotica ALS具有非单体存在的四级结构，推测F276、S277、K279为A. azotica ALS的抗性关键位点，并通过PCR定点突变成功构建了突变基因，获得了大量扩增和表达。本研究揭示了ALS抑制剂的作用机理和致毒机制，丰富了蓝藻基因工程的研究体系，搭建了A. azotica ALS研究的框架结构，填补了该领域的研究空白，不仅具有重要的学术价值，而且为新型除草剂的构效关系研究拓展了新的空间，为有益固氮蓝藻抗性种质资源的培育应用以及除草剂的使用提供了科学依据，具有重要的应用价值，对促进现代绿色生态农业的发展具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1. 固氮蓝藻
• 2. 乙酰乳酸合酶抑制剂
• 3. 乙酰乳酸合酶
• 4. 生物信息学方法与蛋白质功能研究
• 5. 论文选题依据及意义
• 第二章 ALS 抑制剂对固氮鱼腥藻的毒性研究
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 丙酮对固氮鱼腥藻的生长效应
• 2.2 苄嘧磺隆对固氮鱼腥藻的生长效应
• 2.3 不同光照条件下苄嘧磺隆对固氮鱼腥藻的生长效应
• 3. 小结与讨论
• 第三章 固氮鱼腥藻 ALS 基因的克隆与测序
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 总 DNA 的提取检测
• 2.2 固氮鱼腥藻 A. azotica ALS 基因的 PCR 扩增
• 2.3 PCR 产物的胶回收
• 2.4 ALS 基因的连接克隆及重组子的检测
• 2.5 固氮鱼腥藻 A. azotica ALS 基因（ilvB）的测序分析
• 2.6 ilvB 序列信息递交
• 3. 小结与讨论
• 第四章 ALS 酶蛋白生物信息学分析
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 A. azotica ALS 基因的核苷酸序列分析
• 2.2 A. azotica ALS 理化性质及二级结构预测
• 2.3 A. azotica ALS 氨基酸序列的比对
• 2.4 A. azotica ALS 系统进化树分析
• 2.5 A. azotica ALS 蛋白功能结构域的预测
• 2.6 A. azotica ALS 蛋白三维结构的预测
• 2.7 蛋白质结构模型合理性评估
• 3. 小结与讨论
• 第五章 固氮鱼腥藻 ALS 的外源表达与检测
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 去终止子 ALS 基因的克隆
• 2.2 重组表达载体的构建与鉴定
• 2.3 IPTG 诱导表达产物的检测
• 2.4 重组菌诱导表达条件的优化
• 2.5 表达产物的纯化
• 2.6 蛋白质浓度与 OD 值的相关性
• 2.7 Acetoin 浓度与 OD 值的相关性
• 2.8 ALS 酶活性测定结果
• 3. 小结与讨论
• 第六章 ALS 酶活性部位分析及敏感性缺失突变体的研究
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 A. azotica ALS 与抑制剂的分子对接
• 2.2 A. azotica ALS PCR 定点突变研究
• 3. 小结与讨论
• 第七章 结论与展望
• 1. 结论
• 2. 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间已发表或录用的论文及专利