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家蚕丝素重链基因应用的相关基础研究

2020-11-23阅读(586)

家蚕丝素重链基因应用的相关基础研究

论文摘要

本文以重组AcMNPV为基因转移载体,构建了家蚕丝素重链基因启动子驱动的含不同长度丝素重链N端序列、C端序列的EGFP融合蛋白的表达框,系统地研究了这些片段对融合蛋白分泌的影响。结果表明,丝素重链N端的两个螺旋和C端64个氨基酸对重组融合蛋白的分泌没有影响,这些序列的部分或全部缺失,融合蛋白能够正常在家蚕后部丝腺合成与分泌;将带丝素重链N端163个氨基酸的融合蛋白通过C端引入的His-tag纯化标签进行纯化,测定成熟蛋白的N端序列,证明丝素重链的信号肽切点发生在第21和22氨基酸之间。通过对信号肽序列的系统缺失分析表明,能够使重组蛋白正常分泌的信号肽最短长度是12个氨基酸,但此时重组蛋白的分泌效率已经有所降低,并且信号肽的切点向后转移至EGFP内;丝素重链信号肽缩短到11个氨基酸,重组蛋白不能分泌;信号肽疏水区的最短长度是8个氨基酸;丝素重链信号肽长度为16个氨基酸时,融合蛋白能够正常分泌,信号肽的切点正好发生在接口序列和EGFP之间,成熟蛋白的第一个氨基酸是EGFP的第一个Met,这一结构适用于外源基因表达时,更好地控制成熟蛋白的N端序列。以AcMNPV为基因转移载体,利用丝素重链基因启动子,将人工合成拼接的丝蛋白基因在家蚕后部丝腺获得了表达。表达的人工合成丝蛋白能够在家蚕后部丝腺正常分泌,并且能特异地与先前制备的蜘蛛丝蛋白多克隆抗体反应,这为利用生物工程技术改造蚕丝性能提供了一定的实验基础。我们在丝素重链基因的3’侧翼区发现了一段插入序列BmTH3,该插入序列的发生在家蚕不同地理品系和野蚕之间存在显著差异,插入发生在大部分日系品

论文目录

  • 专用名词缩写
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 引言
  • 参考文献
  • 第一章 用重组ACMNPV 为载体在家蚕体内研究丝素重链信号肽
  • 引言
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 第一节 丝素重链基因相关序列的克隆
  • 第二节 FibH-EGFP 融合蛋白在家蚕后部丝腺的表达和分泌
  • 第三节 丝素重链N 端两个螺旋对重组蛋白分泌的影响
  • 第四节 丝素重链信号肽的切点
  • 第五节 丝素重链信号肽的结构分析
  • 讨论
  • 本章小结
  • 参考文献
  • 第二章 人工合成丝基因在家蚕丝腺中的表达
  • 引言
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 第一节 仿蜘蛛拖牵丝和仿蚕丝基因片段的人工合成
  • 第二节 含人工合成丝基因病毒表达载体的构建
  • 第三节 人工合成丝基因在家蚕后部丝腺的表达
  • 讨论
  • 本章小结
  • 参考文献
  • 第三章 家蚕丝素重链基因3’侧翼区序列的多态性
  • 引言
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 第一节 家蚕品种54A 重链基因的3’端侧翼区
  • 第二节 不同家蚕品种间丝素重链基因3’端序列的多态性
  • 第三节 插入序列在家蚕基因组中的分布
  • 第四节 Bm TH3 的序列分析
  • 第五节 家蚕基因组中的一个转座酶编码序列
  • 讨论
  • 本章小结
  • 参考文献
  • 全文结论
  • 附件
  • 博士期间发表论文
  • 致谢
  • 中科院上海生命科学研究院研究生学位论文声明
  • 研究生学位论文版权使用授权声明

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