猪胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素的克隆表达及表达产物对小白鼠的免疫保护性研究

论文摘要

猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的一种传染性呼吸道疾病。该病在各年龄阶段的猪均有发生。临床症状以病猪呼吸困难为特征,病理变化主要是肺部不同程度的充血、出血和纤维素性肺炎,该病的发病率和死亡率常在20%以上,在我国的发生呈现上升趋势,给我国的养猪业造成了严重的经济损失。APP的致病因子较多,包括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白及溶血毒素（Apx）等,其中溶血毒素是最重要的致病因子。研究APP毒力因子的致病作用有利于毒力因子亚单位疫苗或基因工程疫苗的研究,同时对有效疫苗的选择和应用,预防和控制本病也具有重要意义。本研究内容分两个部分:第一部分:猪胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素的克隆与表达。参照GenBank已发表的血清5型胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA基因序列和血清3型胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA基因序列,设计4对引物。对从山东省分离的血清5型和血清3型的放线杆菌进行PCR扩增,分别得到1095bp、1017bp、1462bp和537bp的目的片段。测序结果表明,分离菌株ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA核酸片段基因序列与标准菌株的相应序列同源性达99%以上。将扩增的核酸片段分别克隆入原核表达载体pGEX-5X-3中,然后转化大肠杆菌BL21,经终浓度1mmol/L的IPTG诱导2h后,SDS-PAGE结果显示,ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅢA和ApxⅣA获得高效表达,分别得到58 kDa、66kDa、82kDa和49kDa的融合蛋白条带。在Western-blotting中,抗APP血清5型和3型的高免血清能识别这些毒素的蛋白条带。此检测结果表明,表达产物具有免疫活性。第二部分:溶血毒素表达产物的纯化及对小鼠免疫保护性的研究。通过硫酸铵盐析和Sephadex G-200凝胶过滤层析纯化表达产物。按照不同组合将表达产物与弗氏佐剂等比例混合,制备3种亚单位疫苗。并在30日龄和45日龄免疫小白鼠,在60日龄分别用血清1、3、5、7和10型胸膜肺炎放线杆菌攻毒。血清1、5和7型胸膜肺炎放线杆菌攻毒后, 3种亚单位疫苗分别提供58.4%、66.6%和91.7%的保护率。免疫含四种融合蛋白的亚单位疫苗的小白鼠剖检可见肺脏,肝脏仅呈现轻微的出血和肿大,病理组织学观察,肝细胞坏死数较少,肺泡内出血较轻,肺间质轻微增厚。试验结果表明表达产物具有免疫保护作用,且含有四种表达产物的亚单位疫苗对小鼠的免疫保护效果最佳。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 1. 病原学
• 1.1 胸膜肺炎放线杆菌的概述
• 1.2 胸膜肺炎放线杆菌的病原特性
• 1.3 胸膜肺炎放线杆菌的血清型
• 1.4 胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子
• 1.4.1 溶血毒素
• 1.4.2 荚膜多糖
• 1.4.3 脂多糖
• 1.4.4 外膜蛋白
• 1.4.5 转铁结合蛋白
• 1.4.6 酶类
• 1.4.7 粘附因子
• 2. 流行病学
• 3. 临床症状与病理变化
• 3.1 临床症状
• 3.2 病理变化
• 4. 预防控制
• 4.1 加强饲养管理
• 4.2 药物控制
• 4.3 免疫预防
• 4.3.1 灭活疫苗
• 4.3.2 亚单位疫苗
• 4.3.3 弱毒疫苗
• 4.3.4 ghost 疫苗
• 4.3.5 口服疫苗
• 5 展望
• 试验一 猪胸膜肺炎放线杆菌溶血毒素的克隆与表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂与仪器
• 1.1.2 菌株
• 1.2 溶血毒素A 基因的引物设计
• 1.3 溶血毒素A 基因的克隆与转化
• 1.3.1 细菌的培养
• 1.3.2 基因组DNA 的提取
• 1.3.3 PCR 扩增溶血毒素 A 基因
• 1.3.4 PCR 产物的回收、连接、转化
• 1.3.5 重组质粒的酶切
• 1.4 目的片断和载体的酶切、电泳及回收
• 1.4.1 目的片断与pGEX-5X-3 的酶切
• 1.4.2 酶切产物的电泳及回收
• 1.5 DNA 的连接与转化
• 1.6 质粒DNA 的提取与酶切
• 1.7 重组质粒的诱导表达
• 1.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.8.1 电泳样品的制备
• 1.8.2 SDS-PAGE 电泳
• 1.9 表达产物的 Western-blotting 检测
• 2 结果
• 2.1 不同溶血毒素 A 基因 PCR 扩增结果
• 2.2 不同溶血毒素 A 基因序列分析
• 2.3 不同溶血毒素 A 基因双酶切结果
• 2.4 不同诱导时间表达产物的含量
• 2.5 表达产物免疫原性检测
• 3. 讨论
• 试验二 APP 溶血毒素表达产物的纯化及对小鼠免疫保护性研究
• 1材料与方法
• 1.1 菌株
• 1.2 试剂及仪器
• 1.3 实验动物
• 1.4 重组蛋白的纯化
• 1.4.1 重组蛋白的表达
• 1.4.2 硫酸铵盐析
• 1.4.3 重组蛋白的透析与浓缩
• 1.4.4 Sephadex G-200 凝胶过滤层析
• 1.4.5 重组蛋白浓度的测定
• 1.5 亚单位疫苗的制备
• 1.6 动物分组与免疫
• 1.7 病理学检查
• 1.7.1 临床病理变化观察
• 1.7.2 病理组织学观察
• 2 结果
• 2.1 硫酸铵盐析
• 2.2 Sephadex G-200 凝胶过滤层析
• 2.3 蛋白质纯度的鉴定
• 2.4 临床症状与剖检变化
• 2.5 病理组织学变化
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文情况