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菊芋液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆及其转基因烟草的耐盐性研究

2020-12-02阅读(1045)

菊芋液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆及其转基因烟草的耐盐性研究

论文摘要

盐分对植物的伤害主要是Na+引起的,而Na+/H+逆向转运蛋白催化Na+和H+的逆向跨膜运输,是植物抵御盐胁迫的主要方式之一,在植物耐盐性方面起着重要的作用。对于植物Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆、表达及功能的分析将对植物耐盐基因工程产生重要意义。通过GenBank上登录的其它植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的同源序列设计一对简并引物,利用RT-PCR和RLM-RACE技术获得了菊芋液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的cDNA全序列,命名为HtNHX1。HtNHX1 cDNA全长2148bp,5′端非编码区长269bp,3′端非编码区长501bp,含有1个可能的加polyA信号:AATAA,开放阅读框含有1647个核苷酸,编码一个由549个氨基酸构成的多肽,并且含有Na+/H+逆向转运蛋白的高度保守序列LFFIYLLPPI,这是Na+/H+逆向转运蛋白活力的竞争性抑制剂氨氯吡嗪嘧的结合位点。HtNHX1的氨基酸序列与已克隆的花花柴KcNHX2、水稻OsNHX2、莲花NcNHX1、矮牵牛PhNHX1、牵牛花InNHX2、玉米ZmNHX5的Na+/H+逆向转运蛋白具有很高的同源性,分别为80%,74%,72%,74%,74%,70%。同时根据RLM-RACE的原理和5′端非编码区序列的分析,推测出目的基因上游的转录起始位点可能为a,为该基因表达调控方面的研究奠定了基础。根据HtNHX1基因全长序列设计引物扩增其编码区,并将其克隆到pUC19载体中,经测序确认,保留未发生突变的克隆体,用于构建其植物表达载体pBI121-HtNHX1。冻融法将pBI121-HtNHX1重组质粒导入根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）LBA4404中,获得工程菌LBA4404-pBI121-HtNHX1。农杆菌介导法将HtNHX1基因编码区导入烟草（Nictiana tabacum L.cv.89）,获得卡那霉素抗性植株。PCR、RT-PCR均证明外源HtNHX1基因已整合到烟草基因组中。转基因烟草具有一定的耐盐性,能在含200 mmol/L NaCl的培养基中正常生长2周,而对照则在100 mmol/L NaCl处理时便不生根。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 一、盐胁迫对植物的危害和植物对盐胁迫的反应机制
  • 1 盐胁迫对植物造成的伤害
  • 2 植物盐适应的机制
  • +/H+逆向转运蛋白研究进展'>二、Na+/H+逆向转运蛋白研究进展
  • +/H+逆向转运蛋白的发现'>1 Na+/H+逆向转运蛋白的发现
  • +/H+逆向转运蛋白的生理功能及分子特征'>2 Na+/H+逆向转运蛋白的生理功能及分子特征
  • +/H+逆向转运蛋白与植物耐盐性的关系'>3 Na+/H+逆向转运蛋白与植物耐盐性的关系
  • +/H+逆向转运蛋白的克隆、表达调控及遗传转化研究'>4 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的克隆、表达调控及遗传转化研究
  • 三、菊芋及其耐盐机制研究
  • 四、RACE技术在植物基因克隆中的应用
  • 1 RACE原理
  • 2 新型RACE技术
  • 3 RACE在植物基因克隆上的技术优势、应用现状及其发展前景
  • 五、小结
  • +/H+逆向转运蛋白基因的克隆'>第二章 菊芋液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆
  • 一、菊芋的总RNA的制备与检测
  • 1 材料与方法
  • 2 结果与分析
  • 3 结论
  • +/H+逆向转运蛋白基因克隆'>二、Na+/H+逆向转运蛋白基因克隆
  • 1 材料和方法
  • 2 结果与分析
  • 3 讨论
  • 4 小结
  • 三、RT-PCR分析菊芋中HtNHX1基因的表达特性
  • 1 材料与方法
  • 2 结果与讨论
  • +/H+逆向转运蛋白基因表达载体的构建'>第三章 菊芋液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因表达载体的构建
  • 一、材料与方法
  • 1 试剂
  • +/H+逆向转运蛋白基因编码区的获得'>2 菊芋液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因编码区的获得
  • +/H+逆向转运蛋白基因植物表达载体的构建'>3 菊芋液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因植物表达载体的构建
  • 二、结果与分析
  • 三、讨论
  • 四、小结
  • 第四章 转化烟草及转基因烟草的耐盐性研究
  • 一、材料与方法
  • +/H+逆向转运蛋白基因转化烟草'>1 Na+/H+逆向转运蛋白基因转化烟草
  • 2 转化植株的分子检测
  • 3 转基因植株的耐盐性检测
  • 二、结果与分析
  • +/H+逆向转运蛋白基因转化烟草'>1 菊芋液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因转化烟草
  • 2 转化植株的PCR检测
  • 3 转基因烟草的耐盐性鉴定
  • 4 转基因植株组培室壮苗
  • 三、讨论
  • 四、小结
  • 全文结论及展望
  • 一、全文结论
  • 二、创新点
  • 三、有待于进一步开展的工作
  • 四、展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表论文情况
  • 附录

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