基于LHRHa修饰的卵巢癌细胞靶向脂质体给药系统的研究

论文摘要

卵巢恶性肿瘤是危害女性健康的三大恶性肿瘤之一，其死亡率极高。虽然目前手术方法有所改进、新的化疗药不断出现，但仍有60％以上的顽固性卵巢癌经治疗后复发，其中很大原因是由于部分顽固性卵巢癌对化疗不敏感或部分患者无法耐受化疗毒副作用而放弃化疗。因此，运用新的手段将化疗药物定向输送至肿瘤部位是解决这一难题的有效方法，而靶向给药系统正可以定向地传递药物至靶部位。研究报道70％～80％的卵巢癌细胞上都高度表达一个10肽的LHRH（促黄体生成素释放激素）受体，而在其他的体内正常组织器官上几无LHRH受体，LHRH及其类似物（LHRH analogues，LHRHa）可以与癌细胞上的受体特异性结合。LHRH在体内的半衰期非常短（2-3分钟）；而在LHRH6位和10位氨基酸进行置换或去除，得9肽的LHRHa，半衰期可达5小时以上，而与受体亲和力并没有下降。因此，可以利用LHRHa对受体的靶效应，将LHRHa用作载体载上细胞毒性药物，如化疗药等，从而提高药物疗效，减少外围毒性，降低毒副作用。配体实现其载药靶向性的方法可以选择将配体共价结合到药物上，制成具有靶向作用的前药；也可以将配体共价结合到给药载体上，载体携带药物可以在配体的引导下特异性地靶向输送到靶部位；也可以通过静电吸附的方法将配体吸附到给药系统表面，实现靶向性。本研究采用负电性脂质材料所制备的负电性脂质体，可以吸附具正电荷的靶向配体LHRHa。多烯紫杉醇作为半合成的紫杉烷类化合物，治疗铂类耐药的卵巢癌具有较好的效果，对使用紫杉醇耐药的卵巢癌患者使用多烯紫杉醇治疗仍然有效，因此目前多烯紫杉醇已被列入治疗卵巢上皮癌的一线用药。因此本研究在制备能靶向于卵巢癌细胞的给药系统时，选择多烯紫杉醇作为模型药物。研究首先合成负电性的琥珀酸单胆固醇酯（cholesterol succinimide，CHS），以CHS代替胆固醇，制备载多烯紫杉醇脂质体（Doc-Lipo）。LHRHa-多烯紫杉醇脂质体复合物LHRHa-Doc-Lipo的制备分两部进行：第一步制备载药脂质体Doc-Lipo，第二步在脂质体表面吸附LHRHa，得到LHRHa-Doc-Lipo。首先确定了薄膜-超声法用于脂质体的制备；以透析法测定脂质体对药物的包封率，然后通过单因素实验筛选影响脂质体质量的各种因素，并从中找出影响最显著的关键因素，然后通过中心组合设计，优化处方和工艺，所制备的脂质体包封率91．34％，载药量20．49％，粒径342nm，多分散指数0．255，表面电荷-31．9mV。为制备LHRHa-Doc-Lipo，通过试验筛选，确定加入CHS 1／2量的LHRHa，制备LHRHa-脂质体复合物（LHRHa-Doc-Lipo）。为增加脂质体的稳定性，试验确定选择葡萄糖、乳糖、甘露醇各2％（m／V）为支架剂，所制备的脂质体冻干粉在4℃、-20℃条件下可保持至少稳定3个月。制备LHRHa-荧光脂质体（LHRHa-Flu-Lipo），体外细胞吞噬实验证实，人卵巢癌SKOV3细胞对其吞噬作用是普通荧光脂质体（Flu-Lipo）的1．5～2倍左右，这种对LHRHa-Flu-Lipo的优势吞噬作用在用过量游离LHRHa饱和细胞表面受体后被阻断。而其它肿瘤细胞对LHRHa-Flu-Lipo和Flu-Lipo的吞噬并没有明显差异，证实了该给药系统的卵巢癌细胞特异靶向性。为进一步验证LHRHa-Doc-Lipo的体内靶向性，建立了Doc的体内检测方法，通过测定药物体内分布。建立卵巢癌皮下移植模型，分别采用器官总药量百分比和给药剂量百分比评价靶向性。以器官总药量百分比计算，肿瘤中药物含量，5min LHRHa-Doc-Lipo组是Doc-Lipo组的1．12倍，是TAX组的1．33倍；15min LHRHa-Doc-Lipo组是Doc-Lipo组的1．17倍，是TAX组的1．43倍；60min LHRHa-Doc-Lipo组是Doc-Lipo组的1．85倍，是TAX组的3．08倍。以给药剂量百分比计算，肿瘤中药物含量，5min LHRHa-Doc-Lipo组是Doc-Lipo组的1．15倍，是TAX组的1．89倍；15min LHRHa-Doc-Lipo组是Doc-Lipo组的1．23倍，是TAX组的3．0倍；60min LHRHa-Doc-Lipo组是Doc-Lipo组的1．36倍，是TAX组的4．28倍。综上所述，本研究建立的LHRHa-Doc-Lipo给药系统，在显著提高脂质体载药量的基础上又能显示一定的体内、外靶向性，是一种有潜力的化疗药物主动靶向给药系统。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 中英文缩写对照
• 第一部分 电负性脂质材料琥珀酸单胆固醇酯的合成
• 1 仪器与试药
• 1.1 仪器
• 1.2 试药
• 2 方法与结果
• 2.1 琥珀酸单胆固醇酯（CHS）的合成
• 2.2 产物验证
• 2.2.1 薄层板展开
• 2.2.2 熔点测定
• 2.2.3 产物H3-NMR特征
• 3 结论与讨论
• 第二部分 载多烯紫杉醇脂质体的制备及相关性质研究
• 1 仪器与试药
• 1.1 试药
• 1.2 仪器
• 2 方法与结果
• 2.1 多烯紫杉醇含量测定方法的测定
• 2.1.1 UV吸收光谱的测定
• 2.1.2 色谱条件
• 2.1.3 HPLC测定样品制备
• 2.1.4 HPLC方法验证
• 2.1.4.1 专属性考察
• 2.1.4.2 线性关系及范围与检测限、定量限
• 2.1.4.3 精密度测定
• 2.1.4.4 加样回收率测定
• 2.1.4.5 重复性试验
• 2.2 多烯紫杉醇脂质体的制备
• 2.2.1 多烯紫杉醇脂质体制备工艺评价指标
• 2.2.1.1 包封率
• 2.2.1.1.1 常用包封率测定方法
• 2.2.1.1.2 包封率测定方法选择
• 2.2.1.2 载药量
• 2.2.1.3 粒径与粒径分布
• 2.2.1.4 表面电荷
• 2.2.2 多烯紫杉醇脂质体工艺及处方优化单因素筛选试验
• 2.2.2.1 脂质体制备方法选择
• 2.2.2.2 磷脂种类选择
• 2.2.2.3 缓冲盐种类选择
• 2.2.2.4 探头超声条件考察
• 2.2.2.5 胆固醇/磷脂比例考察
• 2.2.2.6 投药量考察
• 2.2.2.7 总脂质材料投量考察
• 2.2.2.8 缓冲盐溶液用量考察
• 2.2.3 小结
• 2.3 中心组合设计优化制备工艺
• 2.3.1 球面设计原理
• 2.3.2 处方优化
• 2.3.2.1 因素、水平设定及实验设计
• 2.3.2.2 优化实验样品制备
• 2.3.2.3 优化实验结果
• 2.3.2.4 数据处理分析
• 2.3.2.5 模型拟合
• 2.3.2.6 优化处方预测
• 2.3.3 优化验证
• 2.4 载多烯紫杉醇脂质体的质量评价及稳定性初步研究
• 2.4.1 形态观察
• 2.4.2 粒径、分布及电位测定
• 2.4.3 包封率与载药量
• 3 结论与讨论
• 第三部分 LHRHa-Doc-Lipo及冻干粉针剂的制备与相关性质研究
• 1 仪器与试药
• 1.1 试药
• 1.2 仪器
• 2 方法与结果
• 2.1 Doc-Lipo-LHRHa的制备
• 2.1.1 Doc-Lipo-LHRHa的制备方法
• 2.1.2 Doc-Lipo-LHRHa中LHRHa加入量的选择
• 2.2 脂质体冻干粉针剂的制备
• 2.2.1 冻干支架剂的选择
• 2.2.2 试验安排
• 2.2.3 考察指标
• 2.2.4 支架剂的确定
• 2.3 冻干制剂的质量评价及初步稳定性研究
• 2.3.1 冻干粉针剂质量评价
• 2.3.1.1 冻干针剂的制备
• 2.3.1.2 外观及再分散性
• 2.3.1.3 形态与粒径
• 2.3.1.4 pH值
• 2.3.1.5 药物含量、包封率和载药量
• 2.3.2 冻干粉针剂稳定性考察
• 3 结论与讨论
• 第四部分 LHRHa-Lipo的体外肿瘤细胞摄取研究
• 1 仪器、试药与细胞系
• 1.1 仪器
• 1.2 试剂
• 1.3 细胞系
• 2 方法与结果
• 2.1 细胞培养与接种操作
• 2.1.1 细胞复苏
• 2.1.2 细胞传代
• 2.1.3 细胞冻存
• 2.1.4 细胞板接种
• 2.2 荧光素脂质体的制备及其制剂学性质研究
• 2.2.1 荧光脂质体的制备
• 2.2.1.1 普通荧光脂质体
• 2.2.1.2 LHRHa-荧光脂质体复合物
• 2.2.2 荧光脂质体的粒度与电荷
• 2.3 细胞对荧光脂质体的吞噬
• 2.3.1 基本操作
• 2.3.1.1 吞噬操作
• 2.3.1.2 荧光测定
• 2.3.1.3 总蛋白的测定
• 2.3.2 细胞对荧光脂质体的吞噬
• 2.3.2.1 培养基对吞噬的影响
• 2.3.2.2 Lipo-LHRHa中脂质材料CHS/LHRHa比例对吞噬的影响
• 2.3.2.3 不同细胞系对荧光脂质体的吞噬
• 2.3.2.3.1 SKOV3对荧光脂质体的吞噬
• 2.3.2.3.2 C26细胞对荧光脂质体的吞噬
• 2.3.2.3.3 Hela细胞对荧光脂质体的吞噬
• 2.3.2.3.4 A549细胞对荧光脂质体的吞噬
• 2.3.2.4 不同细胞系对荧光脂质体吞噬数据分析
• 2.4 LHRHa-Lipo SKOV3细胞毒性实验
• 2.4.1 实验操作
• 2.4.2 测试结果
• 3 结论与讨论
• 第五部分 LHRHa-Doc-Lipo在荷瘤裸鼠体内药物分布研究
• 1 仪器、试药与实验动物
• 1.1 仪器
• 1.2 试药
• 1.3 实验动物
• 2 方法与结果
• 2.1 人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型建立
• 2.1.1 SKOV3细胞培养
• 2.1.2 肿瘤模型建立
• 2.2 体内药物含量测定方法的建立
• 2.2.1 色谱条件
• 2.2.2 生物样品预处理及测定
• 2.2.2.1 血浆样品预处理
• 2.2.2.2 心、肝、脾、肺、肾、子宫附件及肿瘤样品前处理
• 2.2.2.3 样品测定方法
• 2.2.3 分析方法验证
• 2.2.3.1 线性、范围,检测限与定量限
• 2.2.3.2 回收率实验
• 2.2.3.2.1 萃取回收率实验
• 2.2.3.2.2 方法回收率试验
• 2.2.3.3 精密度考察
• 2.3 多烯紫杉醇市售制剂、普通脂质体及脂质体-LHRHa复合物在实验动物体内药物分布
• 2.3.1 试验用药品的配制
• 2.3.2 取样时间点设计
• 2.3.3 药物体内分布实验
• 3 结论与讨论
• 结论
• 综述
• 致谢
• 作者简介