水稻AIP的RNA干扰和原核表达研究

论文摘要

细胞骨架在植物生长发育中发挥了十分重要的作用。其中,微丝骨架结合蛋白在微丝骨架动态变化的过程中起着关键的调控作用,它们的调控保证了细胞分裂、细胞生长以及植物发育和形态建成的正常进行。本研究为了证明OsAIP的重要功能,一方面构建RNAi载体转化水稻,得到遗传数据,从体内分析其重要功能;一方面进行蛋白质原核表达,摸索纯化条件纯化OsAIP,获得高纯度的蛋白质进行生化研究,从体外直接证明OsAIP的重要功能。TCK303载体中包含了UBi-1启动子、两组特异酶切位点和两组酶切位点间的内含子。应用此载体构建RNAi载体,设计一对引物扩增了一条800bp的目标片段,然后用两组酶切和两个连接反应完成整个构建,从而缩短了水稻转化前的载体准备时间。木研究比较了几种原核表达菌株表达OsAIP的效果,证明了Tuner菌株更有利于OsAIP的表达;同时研究了诱导温度对蛋白质表达的影响,发现较低的诱导温度有利于OsAIP的表达,16℃是OsAIP的最佳诱导时间。在摸索纯化条件时,研究发现用Glutathione-Sepherose纯化OsAIP,仍然有少量非特异性条带出现,进一步用Q-Sepherose纯化获得了高纯度的蛋白质,满足了生化试验的要求。同时,为了快速、高效地获得转基因水稻植株,加快水稻研究进程,我们参考了一种快速的水稻转化方法,并在种子培养时间、浸染时间等方面进行了改进,使其更有利于中花11和日本晴的转化,从而证明了该方法具有广泛的应用价值。通过该方法转化水稻,从种子消毒处理到获得T0代再生植株只需要40d左右。并且,转化效率在85%左右,再生效率达到60%左右。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 植物细胞骨架结合蛋白研究进展
• 1.1 植物细胞骨架系统
• 1.2 植物微丝结合蛋白
• 1.2.1 微丝骨架结合蛋白
• 1.2.2 植物AIP1的研究
• 2 水稻转基因研究进展
• 2.1 传统的水稻转化方法
• 2.2 一种快速的水稻转化方法
• 3 RNA干扰的原理及应用
• 3.1 RNA干扰的原理
• 3.2 一种有效的RNA干扰载体TCK303
• 4 研究的目的和意义
• 第二章 OsAIP-RNAi载体的构建及其对水稻的快速转化
• 1 材料与方法
• 1.1 水稻材料、质粒和菌株
• 1.2 感受态细胞的制备
• 1.2.1 DH5α超级感受态细胞的制备
• 1.2.2 EHA105电激感受态细胞制备
• 1.3 RNAi载体的构建
• 1.3.1 引物及PCR
• 1.3.2 OsAIP-RNAi的扩增
• 1.3.3 OsAIP-RNAi目标序列的T克隆
• 1.3.4 OsAIPi载体的构建
• 1.4 电激转化农杆菌
• 1.5 农杆菌介导的水稻快速转化
• 1.5.1 各种培养基成分
• 1.5.2 种子的消毒
• 1.5.3 种子的接种和愈伤组织诱导
• 1.5.4 浸染液的制备
• 1.5.5 愈伤组织侵染和共培养
• 1.5.6 抗性愈伤的筛选
• 1.5.7 分化再生
• 1.5.8 生根培养
• 1.5.9 炼苗及移栽
• 2 结果与分析
• 2.1 序列比对
• 2.2 RNA干扰载体的构建
• 2.2.1 OsAIP目标序列的选取
• 2.2.2 OsAIPi克隆
• 2.2.3 两步法构建RNA干扰载体
• 2.3 水稻快速转化方法的优化
• 2.3.1 不同水稻品种的快速转化
• 2.3.2 愈伤组织浸染的优化
• 2.3.3 种子培养时间选择
• 2.3.4 荧光标记的转基因植株
• 2.4 OsAIPi的转化和分析
• 2.4.1 RNA干扰载体的转化
• 2.4.2 RNAi对再生植株生根的影响
• 2.4.3 RNAi对再生植株死亡率的影响
• 3 讨论
• 3.1 OsAIP-RNAi载体的构建
• 3.2 对水稻快速转化方法的优化
• 3.3 RNA干扰载体的转化
• 第三章 OsAIP的原核表达及蛋白质纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 质粒和原核表达菌株
• 1.2 OsAIP 的克隆
• 1.2.1 引物设计和PCR
• 1.2.2 PCR反应体系
• 1.2.3 PCR产物加poly A尾
• 1.2.4 OsAIP-e的T克隆
• 1.3 原核表达载体的构建
• 1.4 蛋白质纯化
• 1.4.1 表达菌株转化及鉴定
• 1.4.2 GST-OsAIP融合蛋白质的小规模纯化
• 1.4.3 GST-OsAIP融合蛋白质大规模纯化
• 1.5 GST-OsAIP的纯化和抗体的制备
• 2 结果与分析
• 2.1 OsAIP
• 2.2 OsAIP的原核表达载体的构建
• 2.3 OsAIP的原核表达条件
• 2.3.1 诱导温度对OsAIP表达量的影响
• 2.3.2 不同菌株对OsAIP表达量的影响
• 2.4 大规模纯化OsAIP
• 2.5 制抗体用蛋白的纯化
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介