碱性磷酸酶的提取及在线固定化研究

论文摘要

碱性磷酸酶广泛存在于动物、植物、微生物中,直接参与磷酸基团的转移和代谢过程。固定化碱性磷酸酶可以作为分子识别元件,进行多种农药、重金属离子的检测。顺序注射系统在固定化酶在线制备方面具有巨大潜能。在此基础上,本论文进行了以下四方面的研究：1.庄河大骨鸡骨骼粗壮,其生长发育与成骨细胞的快速分化关系密切,而成骨细胞的分化又是在ALP作用下进行。本论文以大骨鸡肝作为酶源,分别采用有机溶剂沉淀法和盐析法提取ALP粗酶液,考察了ALP的催化动力学性质。结果表明：两种方法提取的ALP单位质量比活力相近；ALP粗酶液催化磷酸苯二钠的最适温度为500C,最适酸度为10.8,米氏常数为Km=1.59mmol/L。Pb2+、Ba2+对ALP活力有抑制作用,Ca2+对ALP活力有激活作用。2.以XC-72/PVC复合材料作为载体,顺序注射系统-固相微柱-紫外可见吸收光谱系统为操作平台,对大骨鸡肝ALP进行在线固定化研究,并比较固定化ALP与游离ALP的理化性质。结果表明：与游离ALP相比,固定化ALP适宜温度和酸度范围范围均扩大,分别为50℃～60℃及pH 9.0～10；对底物的亲和性增强,米氏常数为Km= 0.125 mmol/L; Ca2+浓度在0.9 mmol/L以下对固定化ALP活力有激活作用,1.0 mmol/L以上为抑制作用。3.分别采用戊二醛交联的壳聚糖和复合材料XC-72/PVC对大肠杆菌ALP进行了固定化,以生色底物磷酸苯二钠和生荧底物4-甲基伞形酮磷酸酯考察了固定化ALP对底物的亲和力,同时考察了载体材料对两种底物的吸附情况。结果表明：固定化ALP对磷酸苯二钠的亲和力强于对4-MUP；戊二醛修饰的壳聚糖对生荧底物和对应产物的吸附作用显著,而XC-72/PVC仅对生荧产物吸附严重；两种材料对生色底物均无吸附作用,对产物略有吸附。4.采用戊二醛交联的壳聚糖作为载体,考察了ALP在壳聚糖表面的在线共价偶联性能,结果表明：利用共价交联法在线制备的固定化ALP活力明显低于物理吸附法制备的固定化ALP活力,且固定化ALP的稳定性良好,说明在顺序注射系统中利用共价偶联法在线固定化ALP有待进一步探讨。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 碱性磷酸酶简介
• 1.1.1 ALP的结构及理化性质
• 1.1.2 ALP的检测
• 1.1.3 ALP的分离纯化
• 1.2 固定化酶
• 1.2.1 固定化酶方法
• 1.2.2 固定化载体
• 1.2.3 固定化酶性质
• 1.3 顺序注射-固相生物反应器系统
• 1.4 本论文的工作思路和研究目标
• 2 大骨鸡肝ALP提取及在线固定化
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 有机溶剂沉淀法提取ALP
• 2.2.3 盐析法提取ALP
• 2.2.4 ALP的活性测定
• 2.2.5 ALP的在线固定化
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 ALP比活力测定
• 2.3.2 大骨鸡肝ALP的酶促反应动力学性质
• 2.3.3 ALP在XC-72表面在线固定化条件优化
• 2.3.4 固定化ALP的酶促反应动力学性质
• 2.3.5 固定化ALP与游离ALP活力比较
• 2.4 结论
• 3 大肠杆菌碱性磷酸酶的固定化研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 大肠杆菌ALP的在线固定化
• 3.2.3 固定化ALP的活性检测
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 固定化方法
• 3.3.2 固定化载体材料与底物和产物的相互作用
• 3.3.3 固定化ALP的性质
• 3.4 结论
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢