论文摘要
目的:观察靶向沉默FLIP基因对卵巢癌A2780细胞生物学特性的影响,分析RNA干扰前后卵巢癌细胞对TRAIL诱导凋亡敏感性的改变,探讨FLIP基因在TRAIL诱导的凋亡途径中的作用,为卵巢癌的治疗提供新的思路。方法:设计并体外化学合成FLIP序列特异性双链RNA,在脂质体(LipofectamineTM2000)介导下转染人卵巢癌细胞株A2780。采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot法检测FLIP-siRNAs转染前后A2780细胞FLIP基因mRNA和蛋白表达的变化,筛选出抑制作用最强的FLIP-siRNA。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法、Annexin-V-PI双染法流式细胞术（FCM）分别检测FLIP-siRNA对A2780细胞的生长抑制作用和对凋亡的影响。FLIP-siRNAs转染后48h,加50、100、250μg/L浓度的TRAIL处理24h,MTT法检测TRAIL对转染了FLIP-siRNA的A2780细胞的生长抑制作用;Annexin-V-PI双染法流式细胞术（FCM）检测TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的情况。结果:1.FLIPLmRNA在A2780细胞中的表达及FLIPL-siRNA的筛选。通过脂质体(LipofectamineTM2000)将FLIPL-siRNAs转染入卵巢癌A2780细胞,于转染后48h采用半定量RT-PCR检测A2780细胞中FLIPLmRNA的表达水平,结果表明FLIPL-siRNAs可有效抑制A2780细胞中FLIPLmRNA的表达,三种FLIP-siRNAs为FLIPL-1,FLIPL-2和FLIPL-3,其抑制率分别为（77.4±1.2）%,（67.1±1.1）%和（48.3±0.9）%,明显高于对照组,具有统计学意义（P＜0.01）,其中FLIPL-1的抑制作用最强（P＜0.05）。2.FLIPL蛋白在A2780细胞中的表达。FLIPL-siRNA转染入A2780细胞后48h采用Western-blot方法检测A2780细胞中FLIPL蛋白的表达水平,结果表明FLIPL-siRNAs可有效抑制A2780细胞中FLIPL蛋白的表达,FLIPL-1,FLIPL-2和FLIPL-3的抑制率分别为（66.1±1.3）%,（48.6±1.5）%和（36.2±1.6）%,明显高于对照组,具有统计学意义（P＜0.01）,其中FLIPL-1的抑制作用最强（P＜0.05）。3.FLIPL-siRNA对A2780细胞的生长抑制作用。四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测FLIPL-1转染入A2780细胞后24、36、48h FLIPL-1对卵巢癌A2780细胞的生长抑制作用,结果显示,转染后24、36、48h,FLIPL-1对A2780细胞的生长抑制率分别为（7.8±0.3）%,（9.5±0.8）%和（11.2±0.9）%,明显高于对照组,具有统计学意义（P＜0.05）。4.FLIPL-siRNA对A2780细胞凋亡的影响。Annexin-V-PI双染法流式细胞术（FCM）检测FLIPL-1转染入A2780细胞后24、36、48h FLIPL-1对A2780细胞凋亡的影响,结果显示,转染后24、36、48h,A2780细胞的凋亡率分别为（4.63±0.49）%,（6.14±0.55）%和（7.39±0.73）%,明显高于对照组,具有统计学意义（P＜0.05）。5.FLIP-siRNA转染入A2780细胞后TRAIL对细胞的生长抑制作用。FLIP-1转染后48h,加50、100、250μg/L浓度的TRAIL处理24h,MTT法检测不同浓度TRAIL对A2780细胞的生长抑制作用,结果显示,转染FLIPL-1并加TRAIL处理的A2780细胞的生长抑制率分别为（11.9±0.28）%,（16.6±0.40）%和（21.5±0.74）%,明显高于未转染FLIPL-1的各组,具有统计学意义（P＜0.05）。6.FLIP-siRNA转染入A2780细胞后TRAIL对细胞凋亡的影响。FLIP-1转染后48h,加50、100、250μg/L浓度的TRAIL处理24h,Annexin-V-PI双染法流式细胞术（FCM）检测A2780细胞的凋亡情况,结果显示,转染FLIPL-1并加TRAIL处理的A2780细胞的凋亡率分别为（8.72±0.92）%,（11.40±0.96）%和（16.51±0.69）%,明显高于未转染FLIPL-1的各组,具有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.FLIP特异性siRNA介导的RNAi能在转录和翻译水平抑制A2780细胞中FLIP基因的表达。2.RNAi靶向沉默FLIP基因可抑制卵巢癌A2780细胞生长,促进其凋亡。3.RNAi靶向沉默FLIP基因可增加卵巢癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性。
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