在湖南地区分离的人偏肺病毒株的基因分型及其候选疫苗的初步研究

论文摘要

儿童急性呼吸道感染是世界范围内小儿最常见的致病和致死原因之一,目前统计共涉及有七大病毒科的200多种病毒,但人类对呼吸道病原的研究并未完善。在过去的几十年里,由于高敏感性检测方法的建立,使更多的呼吸道感染病毒病原被鉴定,冠状病毒新亚型（SARS,HKU1,NL63）、人博卡病毒等即是近期利用新的方法被检测到的新呼吸道感染病原,从而进一步扩展了急性呼吸道感染病毒病原谱。人偏肺病毒（human metapneumovirus,hMPV）是2001年荷兰学者Van den Hoogen等人从小儿下呼吸道感染样本中分离到的一种新呼吸道病原。根据序列分析结果将其归属于副粘病毒科肺病毒亚科偏肺病毒属,是有包膜的单股负链RNA病毒。基因组全长约13550nt,包括A、B两个基因型,每种基因型又分为两个基因亚型。hMPV与禽偏肺病毒APV-C有较高的同源性。由于我国幅员辽阔,病毒流行特征分布不一。为了解hMPV在我国湖南地区的流行情况,我们以住院儿童为研究对象,调查并分析了hMPV在湖南地区因呼吸道感染入院儿童中的流行情况,分析了hMPV膜蛋白序列的变异情况,结合中国北京地区和世界其它地区公布的相关资料进行了比较分析;根据已有的参考文献及序列分析,选择以中国hMPV流行株（B基因型）为研究对象,初步研究了hMPV B基因型的膜蛋白F、M为基础的疫苗动物实验效果。本文主要的研究内容及结果具体如下:一.住院呼吸道感染患儿中人偏肺病毒的流行状况为了解我国湖南地区hMPV在儿童中的流行情况,探讨其流行特征,2005年在湖南地区采集了232份呼吸道急性感染住院儿童鼻咽抽出物样本（NPA）。经核酸检测,其中17例（7.3%）为hMPV核酸阳性,均为5岁以下患儿,男女比例为11:6。进化分析显示我国湖南地区四种hMPV亚型均有流行,包括A1、A2、B1、B2亚型,北京地区同期流行主要为A2、B2,世界其它地区常以一种基因型为主,且以A型为多。17例hMPV阳性的病人主要临床症状为发热、流涕、喘息、气促等典型的呼吸道感染症状。临床诊断为肺炎（6例）、支气管肺炎（5例）、支气管炎（6例）。在17例hMPV阳性病人中,与其他病毒混合感染有6例,其中RSV（5例）、HBoV（1例）,混合感染率为35%。二、人偏肺病毒膜表面蛋白基因序列特征分析利用RT-PCR技术扩增了我国hMPV G、F、M基因片段。将扩增的膜蛋白全长基因序列与NCBI已经公布的（包括我国在北京地区分离的毒株）核酸序列比较分析发现:hMPV膜蛋白G基因变异较大,核酸变异主要集中在胞外区,基因型之间同源性仅有30～40%,且长度变化大,种类多（711nt,675nt,660nt,696nt）,这些在病毒基因变异分析中较少见。序列变化主要由下列原因引起:无义突变（TAA和TAG的引入）,碱基插入、缺失、颠换等引起氨基酸阅读框突变。hMPV膜蛋白F蛋白序列较保守,F蛋白是主要的病毒抗原,能激发机体产生保护性抗体。基因型之间氨基酸同源性达94%以上,能引起交叉反应,hMPV F蛋白具有与其它副粘病毒科成员相似的特点。因此,选择在本文候选疫苗研究中的主要对象。此外,M蛋白序列最为保守,基因型之间氨基酸同源性达95%以上,在病毒检测中常以M基因为靶序列设计引物。M蛋白在病毒包装和出芽过程中起重要作用,能与膜蛋白及核衣壳蛋白相互作用,所以我们也同时选择它作为本文候选疫苗的抗原。hMPV与人呼吸道合胞病毒的膜蛋白在蛋白特性上有某些共性,推测其在致病与免疫机制方面有相似之处。根据序列分析及已有的文献报道,借鉴其它病毒疫苗（AIDS、hRSV、HCoV等疫苗）的研制,确定hMPV疫苗研究的靶基因为F△TM（F去除穿膜区）,并引入基质蛋白M进行联合免疫。设计构建了嵌有膜蛋白基因F△TM、M的腺病毒载体疫苗及DNA疫苗,将不同形式的疫苗即DNA疫苗与腺病毒载体疫苗联用进行免疫,结果显示疫苗联用比单独应用一种疫苗可以提高体液免疫和细胞免疫水平:DNA疫苗初免一次,腺病毒载体疫苗加强免疫两次,产生的抗体滴度最高,细胞免疫效果也明显。由于呼吸道病毒的侵入方式和途径是以呼吸道上皮为首要部位,因此粘膜免疫在hMPV的预防中尤为重要。本文采用本实验室开发的粘膜免疫组方（JY佐剂系统）进行鼻腔粘膜免疫。结果表明DNA疫苗肌注免疫一次,腺病毒载体疫苗鼻内滴注加强免疫两次,所产生的体液免疫抗体滴度和粘膜免疫sIgA抗体滴度最高,细胞免疫水平效果相当。F△TM、M疫苗联用的效果比单用F△TM疫苗效果好,可能是M、F△TM之间有相互作用从而导致疫苗抗原性增强,提高了免疫效果,其作用机制需要进一步探讨。疫苗免疫反应偏向于Th1免疫反应类型。综上所述,本论文对湖南地区hMPV进行基因分型及膜蛋白序列分析,选择了候选疫苗株,确定了候选疫苗研究的靶抗原,构建了DNA和非复制型腺病毒载体两种疫苗,在动物模型上进行了,单独免疫和联合免疫;注射免疫和鼻腔粘膜免疫的系统的免疫效果评价。本文为进一步探讨我国hMPV的流行监控及疫苗研制奠定了一定的科学基础。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 研究内容与实验设计
• 1.我国人偏肺病毒在住院儿童中流行状况调查
• 2.人偏肺病毒基因进化分析
• 3.人偏肺病毒疫苗的初步研究
• 第一章 湖南地区人偏肺病毒的基因分型及膜蛋白序列分析
• 引言
• 第一节 湖南地区住院儿童人偏肺病毒流行状况调查和基因分型
• 一、材料
• 二、方法
• 三、结果
• 第二节 人偏肺病毒膜蛋白序列特征分析
• 一、材料
• 二、方法
• 三、结果
• 第一章讨论
• 本章小结
• 第二章 人偏肺病毒DNA疫苗、腺病毒载体疫苗的构建及疫苗效果研究
• 引言
• 第一节 人偏肺病毒DNA疫苗的构建与制备
• 一、材料
• 二、方法
• 三、结果
• 第二节 人偏肺病毒腺病毒载体疫苗的构建与制备
• 一、材料
• 二、方法
• 三、结果
• 第三节 人偏肺病毒DNA疫苗、腺病毒载体疫苗的免疫效果研究
• 一、材料
• 二、方法
• 三、动物免疫实验结果
• 第二章讨论
• 第二章小结
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢