应用RNA干扰技术研究线虫酪氨酸磷酸酶PTP-2的生物学功能

论文摘要

SHP-2是一种存在于哺乳动物体内的非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶，它在调节细胞生物的多种信号转导过程及控制细胞活性中发挥着重要的作用。为研究SHP-2的生物学功能，我们选择线虫（Caenorhabditis elegans）作为模式生物，应用RNA干扰技术对PTP-2（线虫中SHP-2）的功能进行了研究。首先，我们设计并合成引物，利用PCR方法从线虫的cDNA文库中扩增出ptp-2基因，克隆到表达载体pGex-2T中，并在E-coli BL21codonplus pLysS中得到了高效表达；其次，我们应用制备电泳获得了高纯度的GST-PTP-2融合蛋白，并将得到的融合蛋白免疫家兔，得到了有较高特异性的PTP-2多克隆抗体；最后，在上述工作基础上，我们应用RNAi技术干扰ptp-2基因在野生型线虫中的表达，通过对线虫生物学表型的研究，我们发现干扰组线虫在寿命以及非正常死亡方面均与对照组线虫有明显差别，说明PTP-2在调控线虫阴道肌肉系统发育的过程中发挥了重要的作用，同时也参与寿命相关的信号传导通路的调控。

论文目录

• 提要
• 英文缩略词
• 前言
• 一、RNA干扰
• 二、线虫
• 三、线虫蛋白酪氨酸磷酸酶 PTP-2
• 四、本论文的实验方案
• 第一部分 ptp-2基因的克隆表达
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株及质粒
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 基本分子生物学实验方法
• 1.2.2 引物设计
• 1.2.3 目的片段的扩增
• 1.2.4 克隆载体的构建和测定
• 1.2.5 表达载体的构建和诱导表达
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 目的片段的扩增
• 1.3.2 克隆载体的构建
• 1.3.3 表达载体的构建
• 1.3.4 PTP-2蛋白的表达
• 1.4 小结
• 第二部分 ptp-2基因表达产物的分离纯化及抗体制备
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试剂及材料
• 2.1.2 缓冲液
• 2.1.3 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PTP-2蛋白的分离纯化
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 PTP-2蛋白的分离纯化
• 2.4 小结
• 第三部分 干扰ptp-2基因后对线虫表型的影响
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株、线虫和质粒
• 3.1.2 缓冲液及培养基
• 3.1.3 仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 表达ptp-2 dsRNA菌株的构建
• 3.2.2 对照组菌株的构建
• 3.2.3 线虫的一般培养
• 3.2.4 对线虫ptp-2基因的干扰
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 dsRNA表达载体的构建
• 3.3.2 对照组细菌构建
• 3.3.3 Western Blot检测干扰效果
• 3.3.4 干扰后线虫表型变化的观测
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 ptp-2 cDNA序列及氨基酸序列
• 中文摘要
• Abstract
• 致谢