棉花细胞质雄性不育系线粒体基因组细菌人工染色体文库的构建及其鉴定

论文摘要

棉花是我国主要的经济作物之一,随着我国纺织工业和人民生活水平的提高,中国已经成为世界上最大的棉花生产国和消费国,对棉花的需求量在不断增加,为了满足人们的需求,培育高产、优质的棉花新品种是解决问题的必然途径。利用棉花细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility,CMS)系培育棉花杂交品种成为当今世界棉花育种的主要研究方向。大量的研究表明,细胞质雄性不育与线粒体DNA的变异有密切的联系。因此,为了更好的研究细胞质雄性不育与线粒体DNA之间的关系,本研究将构建棉花的线粒体基因组细菌人工染色体文库,并对文库进行了初步的评价,为更深入的了解和解释细胞质雄性不育与线粒体之间的关系打下扎实的基础。本研究以陆地棉细胞质雄性不育系P30A的黄化苗为材料,参考水稻、玉米等主要农作物线粒体基因组细菌人工染色体文库的构建方法,并结合棉花本身含有棉酚、单宁等易氧化物质的特殊性,建立了一套构建高质量线粒体基因组BAC文库的体系。该体系包含三个至关重要的条件:高分子质量的mtDNA的提取、脱磷效果较好的载体的制备、转化效率较高的感受态细胞的制备。在分离制备线粒体及其DNA的过程中,利用蔗糖不连续密度梯度超速离心获得的线粒体经荧光镜检测表明其完整性好、无叶绿体和细胞核等污染,利用包埋裂解获得的线粒体DNA经过溶胶酶切、PCR扩增等检测反应表明所提取的线粒体DNA的纯度较高、质量较好;对制备的载体经过自连反应检测,脱磷效果较好,自连效率低;对制备的感受态细胞转化效率进行检测,表明其已达到1.22×1010cfu/μg ,即大于1010cfu/μg。进一步表明,上述的三个条件完全符合构建棉花线粒体基因组细菌人工染色体文库的要求。本研究利用所建立的BAC文库构建技术体系,成功的构建了陆地棉细胞质雄性不育系P30A线粒体基因组细菌人工染色体文库。该文库以单克隆形式保存,包含约3840个克隆子,平均插入片段约15.5kb,重组率大于93%,空载率小于6.23%,克隆子的稳定性好,覆盖率超过80倍。此外,利用线粒体基因引物对建立的10个混合池的质粒进行PCR检测, 10个混合池中都含有阳性克隆,证明构建的BAC文库具有一定的代表性,文库质量较高,为后续的育性基因及了解线粒体基因结构、分析功能基因、线粒体DNA序列测定等搭建了技术平台。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 高等植物细胞质雄性不育在分子水平上的研究进展
• 1.1.1 细胞核不育与细胞质雄性不育
• 1.1.2 植物线粒体与 CMS 的关系
• 1.1.3 叶绿体 DNA 及其产物与 CMS
• 1.1.4 与细胞质雄性不育有关的线粒体基因的研究
• 1.1.5 与细胞质雄性不育有关的特异多肽
• 1.1.6 基因工程创造 CMS
• 1.2 棉花细胞质雄性不育在杂种优势中的利用
• 1.3 细菌人工染色体 BAC 文库的研究进展
• 1.3.1 人工染色体载体研究进展
• 1.3.2 人工染色体文库的比较研究
• 1.3.3 BAC 文库在基因组学研究中的应用
• 1.4 立题意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 载体
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 仪器
• 2.1.6 PCR 引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 高分子量线粒体 DNA 的制备
• 2.2.2 载体制备
• 2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.4 文库的构建
• 2.2.5 BAC 文库的评价
• 2.2.6 棉花 P30A 线粒体 DNA BAC 混合池的构建及阳性克隆筛选
• 第三章 结果与分析
• 3.1 线粒体及线粒体 DNA 的提取与制备
• 3.1.1 黄化苗的获得
• 3.1.2 线粒体的提取
• 3.1.3 FDA 荧光染色检测
• 3.1.4 mtDNA 的提取
• 3.1.5 mtDNA 的酶切电泳分析
• 3.1.6 紫外分光光度计检测mtDNA 的纯度
• 3.1.7 mtDNA 的 PCR 检测
• 3.2 BAC 载体 DNA 的制备
• 3.2.1 碱裂解法大提载体 PCC1BAC 质粒
• 3.2.2 载体的纯化及 LambdaDNA 定量
• 3.2.3 闭环载体 DNA 的酶切
• 3.2.4 载体脱磷效果检测
• 3.3 感受态细胞 DH108 的制备以及转化效率的检测
• 3.4 文库的构建
• 3.4.1 mtDNA 的部分酶切
• 3.4.2 大量酶切后 DNA 片段的选择
• 3.4.3 mtDNA 酶切片段的分离
• 3.4.4 连接与转化
• 3.4.5 BAC 文库评价
• 3.4.6 BAC 混和池的构建及筛选
• 第四章 讨论
• 4.1 高质量、高分子量棉花mtDNA 的提取
• 4.2 BAC载体的选择及载体DNA的制备
• 4.3 载体 DNA 的制备
• 4.4 BAC 文库的构建
• 4.5 混合池的筛选
• 第五章 结论
• 第六章 创新点
• 参考文献
• 附录:主要试剂配方
• 致谢
• 作者简介