伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii BE的培养条件及杀虫活性物质的初步探索

论文摘要

线虫一共生菌复合体具有安全性高、杀虫能力强、杀虫谱广的优点,线虫又具有主动搜索能力,所以具有开发成为新型生物杀虫剂的潜力。本实验采用斯氏线虫Steinernera feltia比利时品种为材料,培养该线虫的共生菌Xenorhabdus bovienii BE,将共生菌的生长情况和最佳发酵条件进行测定,从而为进一步对该共生菌的研究及发酵液大规模生产提供必要的前提条件;实验对共生菌发酵液及其成分的杀虫活性进行生物测定,寻找该菌的杀虫活性物质,并对活性物质的性质进行初步研究,从而为害虫的生物防治提供新的微生物杀虫资源。本研究对Steinernera feltia共生菌Xenorhabdus bovienii BE的培养特性和最佳培养条件进行测定;逐步对该共生菌发酵液及其成分的杀虫活性进行生物测定,寻找该菌的杀虫活性物质;对杀虫活性物质的性质进行研究并对其血腔,口服LD50进行测定。1斯氏线虫Steinernera feltia共生菌Xenorhabdus bovienii BE的生长情况:0-6h为延迟期,6-12h为对数生长期,12-22h为稳定期,22h后细菌生长进入衰亡期。在液体NA培养基上,此伯氏致病杆菌的最适培养温度为27.5℃,最佳摇床转速为180r/min,最适pH值范围为7.0～7.5;初始接种量对菌株的生长有明显的影响,最理想的接菌量为6%;250ml三角瓶的最佳装液量为35ml,即最佳装液量为所盛培养基容积的14%。2共生菌杀虫活性物质的探测及生物测定:测定结果显示斯氏线虫Steinernera feltiae比利时品系的共生菌伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii BE发酵液对供试昆虫大蜡螟老龄幼虫有很高的血腔毒性,通过对发酵液硫酸铵盐析和乙酸乙酯抽提物等进行生物测定,发现共生菌的杀虫物质主要为胞外和胞内蛋白成分,且胞内粗提蛋白活性明显高于胞外粗提蛋白。以Marker分子量范围为14.3-97.2kDa为参照,对两种粗提蛋白进行SDS-PAGE分析,发现胞外粗提蛋白在此分子量范围内没有明显的条带,而胞内粗提蛋白则有较明显的五个条带;胞内粗提蛋白在24h和48h后对昆虫的血腔毒性的LD50值分别为4.7316g/L和1.5715g/L;其在5天后对二龄幼虫的口服LD50为253.7579μg/g。胞内粗提蛋白凝胶过滤后呈现为4个峰值,分别对其进行SDS-PAGE分析,只有浓度较大的峰值1和4产生明显条带,分子量分别为约66.4kDa和20.1-29.0kDa之间的两种复合蛋白;分别对它们进行血腔和口服毒性的生测,发现分子量在20.1-29.0kDa之间的两种复合蛋白活性高于分子量约为66.4kDa的杀虫活性,其在24h和48h后对昆虫的血腔毒性的LD50分别为0.3772g/L和0.1238g/L,其在5天后对二龄幼虫的口服LD50为93.0021μg/g。3杀虫粗提蛋白的性质:研究表明胞内粗提蛋白具有较高的热稳定性,测定的盐析最佳硫酸铵饱和度为80%,通过考马斯亮蓝法所得到的蛋白标准曲线及从中得出的标准方程,从中求得胞外粗蛋白含量为316.67μg/ml,胞内粗蛋白含量为580.89μg/ml。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 上篇 文献综述
• 第一章 昆虫病原线虫的研究概况
• 1 昆虫病原线虫分类
• 2 一般生活史和侵染模式
• 3 昆虫病原线虫的致病机理
• 3.1 线虫对寄主昆虫的侵染和寄主组织的破坏
• 3.2 线虫及共生菌对寄主血淋巴的破坏
• 4 昆虫病原线虫的应用和生产
• 第二章 昆虫病原线虫共生菌的研究进展
• 1 昆虫病原线虫共生菌的分类
• 2 共生菌的型态变异
• 3 共生菌与昆虫病原线虫的关系
• 3.1 昆虫病原线虫与其共生菌的协同进化
• 3.2 共生菌与线虫共生的专一性
• 4 共生菌的致病性
• 5 使用昆虫病原线虫及其共生菌的安全性
• 第三章 昆虫病原线虫共生菌代谢产物的研究进展
• 1 共生菌产生的蛋白毒素
• 1.1 杀虫毒蛋白
• 2 脂多糖类物质（LPS）
• 3 抑菌物质
• 3.1 致病杆菌属（Xenorhabdus）抑菌物质
• 3.2 光杆状菌属（Photorhabdus）抑菌物质
• 3.3 细菌素
• 4 胞外酶
• 5 其他代谢产物
• 下篇 研究内容
• 第一章 伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii BE培养特性的研究
• 1 实验材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 供试昆虫
• 1.3 培养基
• 2 实验方法
• 2.1 共生菌培养
• 2.2 共生菌生长曲线的测定
• 2.3 发酵液最佳条件的测定
• 2.4 不同发酵时间发酵液对昆虫血腔毒性的影响
• 2.5 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 共生菌的生长曲线
• 3.2 共生菌最佳发酵条件的测定
• 3.3 不同发酵时间发酵液对昆虫血腔毒性的影响
• 4 结论与讨论:
• 第二章 伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii BE杀虫活性物质的分离和生物测定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 共生菌的培养
• 1.3 共生菌发酵液,各待测液制备
• 1.4 胞内和胞外粗提蛋白的分离
• 1.5 胞外和胞内粗提蛋白含量的测定
• 1.6 胞外和胞内粗提蛋白的SDS-PAGE
• 1.7 生物活性测定
• 1.8 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 菌液中各种成分对昆虫的血腔毒性
• 2.2 胞内,胞外粗提蛋白含量的测定
• 2.3 胞内和胞外粗提蛋白杀虫活性的比较
• 2.4 胞外,胞内粗提蛋白的SDS-PAGE
• 50'>2.5 胞内粗提蛋白对昆虫血腔毒性的LD₅₀
• 3.结论与讨论
• 第三章 伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovienii BE胞内粗提蛋白的性质及纯化初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 共生菌培养
• 1.3 胞内粗提蛋白的提取
• 1.4 胞内粗提蛋白的热稳定性
• 1.5 胞内粗提蛋白盐析的硫酸铵最佳饱和度
• 1.6 胞内粗提蛋白的凝胶过滤
• 1.7 凝胶过滤后各峰值样品的SDS-PAGE
• 1.8 生物活性测定
• 1.9 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 胞内粗提蛋白盐析的最佳硫酸铵饱和度
• 2.2 胞内粗提蛋白稳定性
• 2.3 胞内粗提蛋白的柱层析结果
• 2.4 柱层析后不同峰值处蛋白的SDS-PAGE以及各峰值处的杀虫活性
• 50'>2.5 胞内粗提蛋白柱层析后杀虫活性最高物质对昆虫血腔毒性的LD₅₀
• 50'>2.6 柱层析后杀虫活性最高物质对昆虫口服毒性的LD₅₀
• 3 结论与讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢