抗砷载体的构建以及在喜温硫杆菌中的接合转移

论文摘要

细菌氧化法是用细菌来促进硫化矿氧化的湿法冶金过程,同化学冶金相比较,有对环境污染小、耗能低、浸矿成本低等优势,尤其对处理低品位矿石,具有很大的潜力。现在国内的富矿越来越少,开采贫矿的任务显得日益重要,但是传统焙烧以及化学方法都具有对环境污染大、设备要求高、提取率低和生产成本高的缺点,因此细菌氧化法越来越广泛地应用到实际生产中,目前世界上已经有十余家大规模金矿厂利用细菌氧化法对含硫金矿进行预处理。能够进行生物浸矿的微生物主要是一些在酸性环境中生长的铁或硫氧化细菌。开始以为最适生长温度在30℃左右的氧化硫硫杆菌、氧化亚铁硫杆菌等在浸矿中起主要作用。可是近年来对连续反应浸矿系统微生物种群研究的结果显示,一些最适生长温度为40℃～50℃的中度嗜热细菌,如喜温硫杆菌、氧化亚铁钩端螺旋菌等是浸矿细菌中的优势菌群,在浸矿过程中具有重要作用。通过研究喜温硫杆菌和铁氧化细菌混合培养对浸矿的影响,发现喜温硫杆菌能够显著提高这些铁氧化细菌的浸矿效率,进一步解释和确认了喜温硫杆菌在生物浸矿中的作用。喜温硫杆菌是1994年新命名的菌株。喜温硫杆菌具有嗜热、嗜酸的特性,为G-,端生鞭毛,运动、严格好氧,专性自养硫氧化细菌,短杆状0.7×1.2um。以硫或者硫的复合物作为能源,在含有硫代硫酸钠和四硫酸钾的固体培养基上能生长。菌落圆形,表面光滑、透明,在菌落中央有硫的沉淀。生长最适温度为45℃,在32—58℃范围内都能生长。生长最适pH为2.0—2.5。在处理含砷难冶黄铁矿时由于贫矿含砷高,抑制了浸矿细菌生长,因此迫使人们用遗传学的方法改造浸矿菌株,构建具有较高抗砷能力的工程菌株,以适应实际生产的需要。喜温硫杆菌自从1994年首次报道以来,国外的大量工作集中在它的生理学和在浸矿中的作用方面,未见有对其遗传改造方面的报道,国内关于喜温硫杆菌的研究开展比较晚,尚处于起步阶段。本实验室从云南腾冲分离到一株中度嗜热嗜酸硫氧化杆菌MTH-04,通过对其进行生理生化特性研究和16S rDNA序列分析确定与喜温硫杆菌为同一类群。本实验利用DNA体外重组技术,将大肠杆菌质粒载体pUM3上的抗砷基因簇片

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1. 绪论

1.1 细菌抗砷特性研究进展

1.1.1 细菌抗砷研究的回顾与现状

1.1.1.1 革兰氏阴性菌抗砷基因

1.1.1.2 革兰氏阳性菌抗砷基因

1.1.2 细菌抗砷基因的抗砷机制

1.1.2.1 抗砷调节基因arsR、arsD

1.1.2.2 抗砷结构基因arsA、arsB、arsC

1.2 生物冶金现状与前景

1.3 浸矿用微生物

1.4 喜温硫杆菌的研究进展

1.4.1 喜温硫杆菌的特性

1.4.2 喜温硫杆菌的遗传背景分析

2. 材料和方法

2.1 菌株和质粒

2.2 培养基及培养条件

2.2.1 LB培养基

0培养基（10x）'>2.2.2 Starky-S⁰培养基（10x）

0培养基（1x）'>2.2.3 Starky-S⁰培养基（1x）

2S₂O₃固体培养基'>2.2.4 Starky-Na₂S₂O₃固体培养基

2.2.5 大肠杆菌-喜温硫杆菌接合培养基及菌体洗涤液

2.2.6 培养条件

2.2.7 抗生素使用浓度

2.2.8 菌种保藏

2.3 质粒的提取与纯化

2.3.1 质粒的碱式抽提（大提）

2.3.2 质粒的碱式抽提（快提）

2.3.3 试剂盒提取质粒

2.4 琼脂糖凝胶电泳

2.4.1 电泳缓冲液: Tris-醋酸缓冲液（TAE）

2.4.2 凝胶中琼脂糖含量与分离范围

2.5 DNA浓度、纯度和 DNA分子量的测定

2.6 限制性核酸内切酶酶切技术

2.7 连接

2.8 质粒 DNA的转化

2.9 试剂盒回收琼脂糖凝胶电泳的DNA

2.10 重组菌IPTG的诱导表达

2.11 接合转移

2.11.1 供体菌及受体菌的准备

2.11.2 大肠杆菌与喜温硫杆菌的接合

2.11.3 接合转移子的鉴定

2.11.3.1 提取质粒鉴定

2.11.3.2 反向接合转移鉴定

2.12 质粒稳定性测定

2.13 抗砷基因的表达

2.13.1 抗砷基因在大肠杆菌中的表达

2.13.2 抗砷基因在喜温硫杆菌中的表达

3. 结果与讨论

3.1 抗砷质粒pSDRA3、pSDRA4的构建及特性

3.1.1 抗砷质粒pSDRA3、pSDRA4的构建

3.1.2 重组抗砷质粒的限制性酶切分析

3.2 重组质粒上的抗砷基因在大肠杆菌中的表达

3.3 抗砷质粒pSDRA3、pSDRA4在大肠杆菌和喜温硫杆菌之间的接合转移

3.3.1 抗砷质粒pSDRA3、pSDRA4转化大肠杆菌SM10

3.3.2 质粒 pSDRA3、pSDRA4从大肠杆菌到喜温硫杆菌之间的接合转移

3.3.3 质粒从喜温硫杆菌反向转移到大肠杆菌中

3.4 重组质粒上的抗砷基因在喜温硫杆菌中的表达

3.5 质粒的稳定性

3.6 讨论

参考文献

致谢

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