全脑缺血再灌注大鼠海马Fas凋亡通路激活及HWTX-1干预研究

论文摘要

目的：通过观察HWTX-I大鼠蛛网膜下腔用药对全脑缺血再灌注损伤在体动物模型海马CA1区锥体细胞及胞内线粒体形态结构变化、Fas凋亡通路相关因子核酸及蛋白表达的影响，探讨HWTX-I与由Fas分子启动的死亡信号转导通路之间的关系，确定其在以上模型中神经保护有效性和可能分子机制，为开发一种新型神经保护作用药物提供理论和实验依据。研究方法：成年雄性SD大鼠48只，随机分为3组，即假手术组、非用药组和HWTX-I1.0μg／kg剂量用药组，每组16只；每组8只用于光镜观察海马CA1区Niss1染色锥体细胞显微形态结构变化，电镜观察海马CA1区锥体细胞超微形态结构变化和免疫组化技术检测海马CA1区Fas凋亡通路相关因子蛋白表达变化；另8只用于PCR技术检测海马Fas凋亡通路相关因子mRNA转录水平变化；除假手术组大鼠外，非用药组和用药组大鼠都以“四血管闭塞法”构建全脑缺血再灌流损伤在体动物模型并结合蛛网膜下腔置管术。研究结果：1．光镜观察：在假手术组中，清晰可见数层锥体细胞排列整齐紧密；在非用药组中，锥体细胞排列散乱，分布稀疏，层次不完整；在用药组中，锥体细胞略呈疏散分布状态。2．电镜观察：在假手术组中，锥体细胞线粒体嵴清晰可见，未见其出现断裂现象；在非用药组中，锥体细胞线粒体嵴模糊不清，出现线粒体嵴断裂和线粒体空泡化现象；在用药组中，锥体细胞线粒体嵴未出现明显断裂现象。3．免疫组化定性实验：在假手术组中，几乎未见Fas、FasL（CD95L）、FADD、Caspase-3及Caspase-8蛋白表达；在非用药组中，阳性细胞数量多，较假手术组和用药组有更强Fas、FasL、FADD、Caspase-3及Caspase-8蛋白表达；在用药组中，阳性细胞分布明显较非用药组少而稀疏。4．免疫组化半定量实验：Fas、FasL、FADD、Caspase-3及Caspase-8阳性单位均值以非用药组为最高，其次是用药组，而假手术组最低；非用药组、用药组Fas蛋白表达与假手术组比较，差异具有非常显著性意义（P＜0.01），用药组与非用药组比较差异具有显著性意义（P＜0.05）；非用药组FasL蛋白表达与假手术组比较，差异具有非常显著性意义（P＜0.01），用药组与假手术组比较，差异具有显著性意义（P＜0.05）；非用药组、用药组FADD蛋白表达与假手术组比较，差异具有非常显著性意义（P＜0.01），用药组与非用药组比较差异具有显著性意义（P＜0.05）；非用药组Caspase-3、Caspase-8蛋白表达与假手术组比较，差异具有非常显著性意义（P＜0.01），用药组与非用药组比较，差异具有显著性意义（P＜0.05）；HWTX-I具有较明显降低全缺血再灌注大鼠海马CA1区锥体细胞Fas调亡通路相关因子蛋白表达水平作用。5．RT-PCR技术检测：非用药组Fas、FasL、FADD及Caspase-3 mRNA表达量与假手术组比较，差异都具有非常显著性意义（P＜0.01）；非用药组Caspase-8表达量与假手术组比较，差异具有显著性意义（P＜0.05）；用药组Fas、FasL、Caspase-3及Caspase-8 mRNA表达与非用药组比较差异都具有显著性意义（P＜0.05）；用药组FADDmRNA表达与非用药组比较，差异具有非常显著性意义（P＜0.01）；HWTX-I具有较明显降低全脑缺血再灌注大鼠海马细胞Fas调亡通路相关因子核酸表达水平作用。结论：1．HWTX-I蛛网膜下腔用药具有稳定全脑缺血再灌注损伤SD大鼠海马CA1区锥体细胞及其胞内线粒体形态结构的作用。2．HWTX-I蛛网膜下腔用药对全脑缺血再灌注损伤SD大鼠海马神经组织保护可能通过抑制Fas分子启动的死亡信号转导通路而发挥作用。3．HWTX-I对大鼠海马神经细胞在体外缺血缺氧培养时，钙离子通道和形态机能影响及神经保护量效关系、时效关系、分子机制有待进一步深入研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验动物
• 2.2 主要试剂与仪器
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 实验动物分组
• 2.3.2 实验动物模型构建
• 2.3.3 给药方法
• 2.3.4 取材和切片
• 2.3.5 光镜观察
• 2.3.6 电镜观察
• 2.3.7 免疫组织化学检测
• （1） 免疫组化实验步骤
• （2） 免疫组织化学染色图像的处理与分析
• 2.3.8 总 RNA抽提与 RT-PCR检测
• （1） 总 RNA抽提
• （2） RT-PCR操作步骤
• ①反转录
• ②聚合酶链式反应
• （3） 琼脂糖凝胶电泳
• （4） 图像处理与分析
• 2.3.9 质量控制
• （1） 灭菌
• （2） 灼烧推动脉
• （3） 置管
• （4） 夹闭
• （5） 海马剥离
• （6） 海马 CA1区定位
• 2.4 统计学分析
• 3 实验结果
• 3.1 光镜观察
• 3.2 电镜观察
• 3.3 免疫组织化学检测
• 3.3.1 免疫组化定性实验
• 3.3.2 免疫组化半定量实验
• 3.4 RT-PCR技术检测
• 3.4.1 琼脂糖凝胶电泳结果
• 3.4.2 数据统计结果
• 4 讨论
• 4.1 脑缺血再灌注损伤
• 4.1.1 概念
• 4.1.2 实验动物模型
• （1） 模型选择
• （2） 模型构建
• （3） 实验观察对象选择
• 4.1.3 缺血性脑损伤显微形态特征
• 4.1.4 缺血性脑损伤超微形态特征
• 4.2 细胞凋亡
• 4.2.1 缺血性脑损伤中神经细胞凋亡
• 4.2.2 凋亡通路
• （1） 概念
• （2） 机制
• ①线粒体通路
• I 线粒体凋亡信号整合
• II 线粒体通透性转变
• III Caspases激活
• ②死亡受体通路
• ③内质网通路
• （3） 缺血再灌注脑损伤凋亡通路激活及 HWTX-I干预研究进展
• 4.3 Fas凋亡通路
• 4.3.1 机制
• 4.3.2 相关因子
• （1） Fas与 FasL
• （2） FADD
• （3） Caspases
• 4.3.3 缺血性脑损伤中海马 Fas凋亡通路激活
• （1） Fas和FasL表达
• （3） FADD表达
• （4） Caspase-3表达
• 4.4 脑缺血时钙超载
• 4.4.1 脑缺血时钙超载原因
• 4.4.2 钙超载危害
• 2+超载加重缺血性脑损伤途径'>4.4.3 Ca²⁺超载加重缺血性脑损伤途径
• 4.5 缺血性脑损伤临床抗凋亡治疗
• 4.6 神经保护剂
• 4.6.1 概念
• 4.6.2 特点
• 4.6.4 作用机制
• 4.6.5 治疗时间窗
• 4.6.6 临床实验失败原因
• 4.7 HWTX-I 神经保护作用
• 4.7.1 机制
• 4.7.2 应用前景
• 4.7.3 有待进一步研究的问题
• （1） 量效关系
• （2） 时效关系
• （3） 分子机制
• 5 结论
• 6 参考文献
• 综述
• 附录
• 缩略词表
• 科研情况
• 致谢