论文题目: 大肠杆菌碱性磷酸酶分子改造，高效表达研究及应用
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物学
作者: 黄旭
导师: 张先恩
关键词: 启动子,调控序列,结构基因,信号肽,亲合纯化,筛选系统
文献来源: 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）
发表年度: 2005
论文摘要: 以大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatsae, EAP)的全长phoA基因为模板,进行error-prone PCR,克隆PCR产物到pEK 48载体,转化宿主菌,筛选比活高的突变子。仅经过一轮error-prone PCR,就从将近4000个突变子中,筛选到一个比活高于野生型约10倍的突变子。DNA序列测定表明该突变子在phoA的调控基因上有4个突变,在phoA的结构基因上有3个氨基酸突变。分别对调控序列上的点突变对EAP高表达量的贡献及结构基因的点突变对EAP高比活力的贡献进行了分析。Real-time PCR分析phoA mRNA表明:phoA启动子-10区域-13位的突变增加了启动子的强度,其通过增加phoA基因mRNA的丰度,在转录水平提高了EAP的表达水平。在转录起始位点附近的突变导致mRNA二级结构的自由能显著提高,可以推测此位点通过削弱mRNA的二级结构而增加了EAP的表达水平。在phoA调控序列上的第三个突变位于RBS区域,此突变增强了SD序列和16 s rRNA的互补性,改变了SD序列的二级结构,通过提高翻译起始效率而提高EAP的表达水平。在phoA结构基因上的有义突变除了活性中心Lys328的突变以外,其他远离活性中心的两个氨基酸突变对提高酶活力没有较大的影响,集中分析Lys328突变导致比活力提高可能的原因。经过对K328Q进行了详尽的动力学特性研究表明:和其他Lys328的突变酶一样,328位Lys→Gln的突变选择性的提高了EAP转移酶的活力而降低了水解酶的活力。说明Lys328在维持EAP转移酶和水解酶的平衡中发挥重要作用。高活性EAP 4-186 编码基因phoA 被克隆到pASK75 载体中,克隆基因的上游是tetA 启动子和OmpA 信号肽的编码序列,下游是链霉亲合素(streptavidin, SA)亲合肽Strep-tag II 的编码序列。对EAP-linker-Strep-tag II 融合蛋白质的表达条件进行了优化:包括调整诱导温度,调节诱导物的浓度,选择加入诱导物时菌体的OD595 值,改变诱导的时间及置换信号肽等。在高诱导物浓度下,EAP-linker-Strep-tag II 表达受到抑制,降低诱导物的浓度可以有效诱导EAP-linker-Strep-tag II 的表达。将诱导温度从37℃降到28℃能增加周质空间可溶EAP-linker-Strep-tag II 的表达量。融合蛋白质的表达量随着延长诱导时间而增加。PelB 信号肽代替OmpA 信号肽引导融合蛋白质的外泌,可以完全避免包涵体的产生。使用pASK75 表达载体,可以在较短的时间内,实现EAP 在大肠杆
论文目录:
第一章 大肠杆菌碱性磷酸酶结构与功能的研究
1 概述
2 大肠杆菌碱性磷酸酶的结构及活性中心的构成
3 大肠杆菌碱性磷酸酶的催化机制及反应机理
4 大肠杆菌碱性磷酸酶结构与功能的研究现状
4.1 EAP活性中心Zn~(2+)配位氨基酸对催化功能的影响
4.2 EAP活性中心Mg~(2+)配位氨基酸对催化功能的影响
4.3 EAP活性中心Zn~(2+)和Mg~(2+)配位氨基酸对催化功能的影响
4.4.E AP活性中心磷酸基团配位氨基酸对催化功能的影响
4.4.1 磷酸基团直接配位氨基酸
4.4.2 磷酸基团间接配位氨基酸
4.5 非活性中心氨基酸对催化功能的影响
5 结束语
参考文献
第二章 目的基因在大肠杆菌中高效表达的调控机制
1 概述
2 转录水平的调控
2.1 启动子
2.2 终止子
3 翻译水平的调控
3.1 翻译的起始
3.2 翻译的终止
3.3 m RNA的稳定性
4 密码子的偏好性
5 包涵体形成的抑制
6 融合蛋白质
7 目的蛋白质的定位
7.1 细胞质
7.2 周质空间
7.3 细胞外
8 结束语
参考文献
第三章 大肠杆菌碱性磷酸酶的定向分子进化
摘要
引言
材料与方法
1 材料
1.1 菌株与质粒
1.2 培养基
1.3 材料与方法
2 实验方法
2.1 大肠杆菌质粒的提取
2.2 Error-prone PCR扩增phoA基因
2.3 突变文库的构建及筛选
2.3.1 含有突变基因的质粒文库的构建
2.3.2 感受态细胞的制备
2.3.3 大肠杆菌的转化
2.3.4 文库的筛选
2.4 大肠杆菌碱性磷酸酶高比活菌株DNA序列测定
2.5 大肠杆菌碱性磷酸酶突变体表达载体的构建
2.6 大肠杆菌碱性磷酸酶突变体表达量及比活的分析
2.7 Real-time PCR分析E.coli SM547/pEK 48-1-WT
2.8 pEK 48系列各突变体二级结构分析
2.9 大肠杆菌碱性磷酸酶的表达,提取及纯化
2.10 SDS-PAGE分析蛋白质纯度及分子量
2.11 蛋白质的浓度测定
2.12 野生型和突变型大肠杆菌碱性磷酸酶的催化动力学研究
2.12.1 酶活的测定及pH值对稳态动力学常数的影响
2.12.2 无机磷酸盐对酶促反应的抑制
2.13 Mg~(2+)对大肠杆菌碱性磷酸酶活力的影响
结果与分析
1 大肠杆菌碱性磷酸酶的体外进化实验设计和突变文库的筛选
1.1 大肠杆菌碱性磷酸酶的体外进化实验设计
1.2 Error-prone PCR结果
2 大肠杆菌碱性磷酸酶高比活菌株34-812的序列测定与分析
3 大肠杆菌碱性磷酸酶突变体表达载体的构建
4 大肠杆菌碱性磷酸酶突变体表达量及比活的分析
5 Real-time PCR分析E.coli SM547/pEK 48-1-WT
6 pEK 48系列各突变体二级结构的分析
7 大肠杆菌碱性磷酸酶的表达,提取及纯化
7.1 大肠杆菌碱性磷酸酶的表达和提取
7.2 大肠杆菌碱性磷酸酶的纯化
8 野生型和突变型大肠杆菌碱性磷酸酶的催化动力学研究
8.1 突变酶K328Q动力学结果分析
8.2 pH值对稳态动力学常数的影响
8.3 无机磷酸盐对酶促反应的抑制
9 Mg~(2+)对大肠杆菌碱性磷酸酶活力的影响
讨论
1 启动子的基本组成及特性
2 phoA基因启动子-11位A→G的突变提高启动子效率的机理分析
3 Real-time PCR分析phoA基因m RNA丰度
3.1 Real-time PCR基本原理及方法优势
3.2 Real-time PCR实验结果及数据分析
3.3 Real-time PCR数据可靠性的分析
4 在翻译水平影响蛋白质表达的主要因素
5 信号肽序列的同义突变对蛋白质表达水平的影响
6 phoA结构基因突变氨基酸分析
小结
参考文献
第四章 大肠杆菌碱性磷酸酶的高效表达及纯化
摘要
引言
材料与方法
1 材料
1.1 菌株与质粒
1.2 培养基及配方
1.3 试剂与材料
2 实验方法
2.1 大肠杆菌质粒的提取
2.2 表达载体pASK75-O-4-186-L-S I的构建
2.3 表达载体pASK75-O-4-186-L-S II的构建
2.4 表达载体pASK75-P-4-186-L-S II的构建
2.5 大肠杆菌的转化
2.6 蛋白质诱导表达条件的优化
2.6.1 培养温度和诱导温度的影响
2.6.2 诱导物浓度的影响
2.6.3 诱导时间的影响
2.6.4 诱导前细胞生长状态的影响
2.6.5 信号肽的使用
2.7 细胞各个不同部分及不同类型蛋白质的提取
2.8 SDS-PAGE 分析蛋白质
结果与分析
1 表达载体pASK75-O-4-186-L-S I的构建
2 表达载体pASK75-O-4-186-L-S II的构建
3 表达载体pASK75-P-4-186-L-S II的构建
4 目的蛋白质表达条件的优化
4.1 培养温度和诱导温度的选择
4.2 诱导物浓度的选择
4.3 加入诱导物时细胞OD_(595)值的选择
4.4 诱导时间的优化
4.5 信号肽的使用
讨论
1 分泌表达融合蛋白质的优点
2 利用pASK75表达载体分泌表达大肠杆菌碱性磷酸酶的特点和优势
3 影响EAP在周质空间大量可溶表达的因素及抑制包涵体产生的原因推断
4 使用Strep-tag进行亲合纯化的优势
小结
参考文献
第五章 大肠杆菌碱性磷酸酶亲合肽筛选系统的建立
摘要
引言
材料与方法
1 材料
1.1 菌株与质粒
1.2 培养基及配方
1.3 试剂与材料
2 实验方法
2.1 大肠杆菌质粒的提取
2.2 表达载体pASK75-P-4-186-L-SBP-tag的构建
2.3 表达载体pASK75-P-4-186-L-N9和pASK75-P-4-186-L-N15 的构建
2.4 融合蛋白质表达,提取和纯化
2.5 融合蛋白质酶活及动力学性质的分析
2.6 亲合肽筛选系统的验证
结果与分析
1 表达载体pASK75-P-4-186-L-SBP-tag的构建
2 表达载体pASK75-P-4-186-L-N_9和pASK75-P-4-186-L-N_(15)的构建
3 五种融合蛋白质表达、提取、纯化及酶学特性分析
4 三种融合蛋白质酶活动力学性质的分析
5 亲合肽筛选系统的验证
讨论
1 亲合肽筛选系统构建的依据和必要性
2 高效亲合肽筛选系统的特点和优势
2.1 定向融合的优点
2.2 高灵敏度度,特异性和多样性的原因分析
2.3 大肠杆菌碱性磷酸酶作为报告基因的优势
小结
参考文献
第六章 结论
发表和待发表的文章
致谢
发布时间: 2005-12-02
参考文献
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