氧腈酶催化合成手性药物中间体的研究

论文摘要

研究目的:手性α-氰醇作为手性源可以衍生得到手性α-羟基酮、α-羟基酸酯、β-羟基胺和α-氨基腈等诸多重要的药用、农用和精细化工产品的手性中间体。以氧腈酶为生物催化剂立体选择性的催化合成手性α-氰醇,在形成新的C-C键的同时,产物的分子结构中也被引入了手性。本论文以多种来源的氧腈酶为生物催化剂,催化生成在药物合成中具有重要应用价值的手性α-氰醇的药用中间体;通过固定化技术对不同选择性和不同结构的氧腈酶进行固定后使用,为氧腈酶的工业化应用打下基础;探索新的氧腈酶源,尤其是从微生物中筛选在植物中含量相对较少的S-选择性的氧腈酶,扩大S-型氧腈酶的来源,以期在合成手性药物中间体时,具有廉价易得的S-型氧腈酶可利用。研究方法:1.本研究选取的底物分别为:苯乙醛、5-苯并噻吩甲醛、3,4-亚甲二氧基苯甲醛、3,4-亚甲二氧基苯乙醛和3,4-亚甲二氧基苯丙酮。通过化学法合成出相应的五种外消旋乙酰化α-氰醇和一种由3,4-亚甲二氧基苯甲醛与硝基甲烷反应生成的相应外消旋乙酰化β-硝基醇。以上述产物为标准品探索合适的色谱条件,为准确分析生物转化产物的ee值奠定基础。2.在含有柠檬酸缓冲液的IPE反应体系中,以丙酮氰醇为HCN源,使用苦杏仁（PaHNL）、苹果、樱桃、枇杷和木瓜（CsHNL）五种R-选择性的氧腈酶和橡胶（HbHNL）、木薯（MeHNL）两种S-选择性的氧腈酶为生物催化剂,分别催化五种底物的手性羟腈化反应。以收率和ee值的高低为指标,比较具有相同选择性的氧腈酶转化以上底物的能力。3.以HbHNL为催化剂,催化3,4-亚甲二氧基苯甲醛与硝基甲烷的缩合反应,分别考察有机溶剂的种类、缓冲溶液的浓度、pH值、缓冲溶液的百分含量和硝基甲烷的浓度对生物转化的影响,确定该类生物转化反应的最佳反应条件。4.分别使用多醛基葡聚糖和Eupergit C为固定化载体,与苹果氧腈酶共价结合后,得到相应的固定化酶。进行三因素七水平的均匀设计实验,研究不同条件下生成的多醛基葡聚糖对固定化酶活性的影响。探讨Eupergit C与苹果氧腈酶结合时,缓冲溶液的pH值、浓度和Eupergit C用量对固定化酶活性的影响。分别检测两种方法对苹果氧腈酶固定化的牢固程度。使用5-苯并噻吩甲醛为底物,以收率和ee值的大小为指标,对比固定化酶与游离酶在双相和微水相反应体系中的催化结果。探讨底物分别被固定化苹果氧腈酶循环催化的情况。5.使用磁性微球对HbHNL进行固定化,检测HbHNL被固定化的牢固程度及放置时间对固定化酶活性的影响,探讨固定化酶被循环使用的次数,以3,4-亚甲二氧基苯甲醛为底物,以收率和ee值的大小为指标,对比固定化酶与游离酶在双相和微水相反应体系中的催化结果,探讨底物分别被磁性微球固定化HbHNL循环催化的情况。6.以外消旋2-（苯并噻吩-5-基）-2-羟基乙腈为HCN的供体,以3,4-亚甲二氧基苯甲醛为底物,在磁性微球固定化HbHNL催化下,尝试一次生物转化得到两种具有重要用途的手性α-氰醇。7.从反应体系pH值、酶制剂的种类和用量、丙酮氰醇的用量等方面探讨3,4-亚甲二氧基苯丙酮被手性羟腈化时ee值低下的原因。8.以苯乙酮为底物,优化来源于木瓜氧腈酶（以前未见报道）的催化反应条件,探讨其催化一系列甲基酮底物手性羟腈化的能力。尝试使用多种植物组织粗粉为催化剂,以苯甲醛为转化底物,以期寻找到新的植物来源的氧腈酶。以多份土壤为待筛样品,以扁桃腈为唯一碳源,从中筛选仅产S-型氧腈酶的微生物。结果:1.以Chiralcel OB-H（4.6×250 mm,5μm）为手性固定相,以不同体积百分比的正己烷和异丙醇溶液为流动相,对五种外消旋乙酰化α-氰醇和一种乙酰化β-硝基醇进行了较好的分离。2.苹果氧腈酶催化五种底物生物转化的收率介于24-91%之间,催化生成R-型产物的ee值介于41-97%之间。HbHNL催化五种底物生物转化的收率介于35-85%之间,催化生成S-型产物的ee值介于29-98%之间。3.在含柠檬酸缓冲液（40%v/v,0.2 M,pH 7.5）的MTBE溶液（10 mL）中,当加入的HbHNL量为200μL,硝基甲烷与3,4-亚甲二氧基苯甲醛初始浓度分别为2.4 M和0.3 M时,20-25℃反应24 h后生物转化的收率为71%,ee值为83%。4.使用100 kDa的葡聚糖、葡聚糖和高碘酸钠的用量分别为1.2 g和1.8g、反应130 min时制得的多醛基葡聚糖与1 mL苹果氧腈酶粗提液反应,交联后的固定化酶与游离酶相比保留了53%的酶活。循环催化苯乙醛羟腈化反应10次也未见明显的酶活丧失。循环催化5-苯并噻吩甲醛、3,4-亚甲二氧基苯甲醛和3,4-亚甲二氧基苯乙醛的手性羟腈化反应8次时,分别从不同的使用轮次开始多醛基葡聚糖固定化酶的催化能力开始有了显著降低。在1.2 M,pH 5.0磷酸二氢钠缓冲溶液中,以350 mg的Eupergit C与200μL苹果氧腈酶粗提液反应,制得的Eupergit C固定化酶与游离酶相比保留了69%的酶活。循环催化3,4-亚甲二氧基苯乙醛的手性羟腈化反应8次以上时,产物的ee值下降明显。循环催化苯乙醛、5-苯并噻吩甲醛和3,4-亚甲二氧基苯甲醛手性羟腈化反应10次以上未见明显的酶活降低。以上两种固定化苹果氧腈酶在0℃微水相体系中,表现出了比游离酶更高的转化率和立体选择性。5.磁性微球固定化HbHNL,与游离酶相比酶活保留了44%。放置时间为60天后,固定化酶的活性降低至原游离酶活力的38%,相同条件下的游离酶在放置60天后,酶活降低至原来的17%。固定化酶与游离酶相比,在微水相和双相反应体系中反应的收率无明显变化,但立体选择性则有不同程度提高。在循环催化苯乙醛、3,4-亚甲二氧基苯甲醛和3,4-亚甲二氧基苯乙醛手性羟腈化反应8次的过程中,均未见明显的酶活丧失。循环催化5-苯并噻吩甲醛手性羟腈化反应第6次时,ee值开始下降显著。6.以磁性微球固定化HbHNL为催化剂,外消旋2-（苯并噻吩-5-基）-2-羟基乙腈为HCN供体,催化3,4-亚甲二氧基苯甲醛的手性羟腈化,反应最终的体系中含有7%的（S）-2-（3,4-亚甲二氧基苯基）-2-乙酰氧基乙腈,ee值为97%,体系中63%的2-（苯并噻吩-5-基）-2-羟基乙腈,ee值为27%。7.以等物质的量的丙酮氰醇为HCN供体、加入10 g/L的磁性微球固定化HbHNL,在0℃微水相体系中,催化3,4-亚甲二氧基苯丙酮的羟腈化反应,反应80 min时ee值达到83%。8.新来源的木瓜氧腈酶在含18%的柠檬酸缓冲液（0.1 M、pH 4.0）的MTBE溶液中,具有最佳催化性能。对于苯乙酮和碳链少于7个碳原子的脂肪族甲基酮都具有良好的催化结果,但对于体积较大的芳酮和碳链多于7个碳原子的脂肪族甲基酮催化效果较差甚至不能转化。从土壤中筛选出一株仅产S-选择性氧腈酶的菌株,菌株的归属待定。结论及意义:1.以合成手性药物中间体—手性α-氰醇为目的,以多种来源、不同立体选择性的氧腈酶为生物催化剂,对苯乙醛、5-苯并噻吩甲醛、3,4-亚甲二氧基苯甲醛、3,4-亚甲二氧基苯乙醛和3,4-亚甲二氧基苯丙酮五种底物的手性羟腈化反应进行了系统研究,总体上以苹果氧腈酶和HbHNL催化分别得到R-和S-型手性α-氰醇的立体选择性最高。2.首次对HbHNL催化3,4-亚甲二氧基苯甲醛与硝基甲烷的反应进行了研究,探索了最适反应条件。3.分别以多醛基葡聚糖和Eupergit C为交联剂和固定化载体,首次对苹果氧腈酶粗蛋白进行了较好的固定。不仅酶活保留较好,而且与游离酶相比固定化酶催化底物手性羟腈化的收率和ee值均有不同程度的提高。在循环使用的次数上,以Eupergit C为载体的固定化酶要优于以多醛基葡聚糖为交联剂的固定化酶。为苹果氧腈酶的批量催化及工业化应用奠定了基础。4.首次以磁性微球固定化法对HbHNL进行了固定化研究,固定化的HbHNL仍然保留了较高的催化活性,循环使用性能良好。与游离酶相比固定化HbHNL催化底物的立体选择性更高。为HbHNL的应用提供了新的方便、价廉的固定化方法。5.以外消旋2-（苯并噻吩-5-基）-2-羟基乙腈为HCN供体,以3,4-亚甲二氧基苯甲醛为底物,以磁性微球固定HbHNL为生物催化剂。通过改变氢氰酸的供体,对一次生物转化得到两种手性分子的可行性做了有益的尝试。6.首次探讨了通过抑制手性甲基酮氰醇的分解而提高手性氰醇ee值的方法,对改善甲基酮底物被转化时普遍偏低的ee值具有重要意义。7.首次发现了新来源的CsHNL,对CsHNL催化甲基酮的底物谱做了探讨。筛选到了一株仅产S-型氧腈酶的菌株,对于扩展目前报道较少S-型氧腈酶的来源具有重要意义。

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符号说明

第一章文献综述

1.引言

2.α-氰醇的生物合成法

2.1.脂肪酶介导的拆分外消旋氰醇法

2.2.脂肪酶介导的动态动力学拆分外消旋氰醇法

2.3.氧腈酶催化的手性羟腈化法

3.氧腈酶的分类

4.氧腈酶催化的反应

4.1.HCN与羰基的手性加成

4.2.硝基化合物与羰基的手性加成

5.氧腈酶催化合成药物中间体

5.1.R-型氧腈酶催化的反应

5.2.S-型氧腈酶催化的反应

6.氧腈酶的分子生物学特性

7.氧腈酶的催化机制

8.含金属离子的手性催化剂催化手性α-氰醇的合成

参考文献

第二章化学法制备外消旋乙酰化α-氰醇

1.引言

2.化学法制备外消旋α-氰醇的方法简介

3.羰基化合物与HCN加成反应的讨论

4.化学法合成五种外消旋α-氰醇和一种外消旋β-硝基醇

4.1.仪器与试剂

4.1.1.仪器

4.1.2.试剂

4.2.方法

4.2.1.化合物1-5的合成

4.2.2.有机相中HCN浓度的测定

4.2.3.化合物6的合成

4.2.4.乙酰化反应

4.3.结果

参考文献

附录

第三章氧腈酶催化法制备手性α-氰醇

1.引言

2.氧腈酶催化形成R-和S-型手性α-氰醇

2.1.材料与仪器

2.1.1.材料

2.1.2.仪器

2.2.方法

2.2.1.种仁粗粉的制备

2.2.2.五种植物种仁来源氧腈酶酶活的测定

2.2.3.手性氰醇ee值的测定

2.2.4.手性氰醇绝对构型的确定

2.2.5.五种种仁来源氧腈酶的生物催化反应

2.2.6.HbHNL和MeHNL的生物催化反应

2.2.7.lipase PS-C Ⅱ选择性催化乙酰化反应

2.2.8.氧腈酶催化反应的后处理

2.3.结果与讨论

2.3.1.五种植物种仁来源氧腈酶的酶活

2.3.2.外消旋化合物1-6的手性分离结果

2.3.3.乙酰化氰醇的比旋光度

2.3.4.五种植物种仁来源氧腈酶催化底物的手性羟腈化

2.3.5.HbHNL和MeHNL催化底物的手性羟腈化

3NO₂与3,4-亚甲二氧基苯甲醛的反应'>3.HbHNL催化CH₃NO₂与3,4-亚甲二氧基苯甲醛的反应

3.1.试剂与仪器

3.1.1.试剂

3.1.2.仪器

3.2.方法

3.3.结果与讨论

3.3.1.溶剂的影响

3.3.2.缓冲溶液浓度的影响

3.3.3.缓冲溶液pH的影响

3.3.4.双相体系中缓冲溶液的百分含量对生物转化的影响

3.3.5.硝基甲烷的浓度对生物转化的影响

3.3.6.HbHNL催化其它底物与硝基甲烷的反应

参考文献

附录

第四章固定化苹果氧腈酶催化合成手性药物中间体的研究

1.引言

2.以多醛基葡聚糖为交联剂的固定化法

2.1.试剂与仪器

2.1.1.试剂

2.1.2.仪器

2.2.方法

2.3.结果与讨论

2.3.1.苹果氧腈酶粗蛋白液的酶活

2.3.2.以多醛基葡聚糖为交联剂的固定化原理

2.3.3.不同条件下制备的多醛基葡聚糖对固定化苹果氧腈酶活的影响

2.3.4.多醛基葡聚糖固定化苹果氧腈酶的酶活

2.3.5.多醛基葡聚糖固定化苹果氧腈酶的酶漏检测

2.3.6.多醛基葡聚糖固定化苹果氧腈酶循环催化5-苯并噻吩甲醛的手性羟腈化

2.3.7.多醛基葡聚糖固定化苹果氧腈酶循环催化其它底物手性羟腈化

3.以Eupergit C为固定化载体的固定化法

3.1.方法

3.2.结果与讨论

3.2.1.缓冲溶液pH值对固定化酶活的影响

3.2.2.缓冲溶液浓度对固定化酶活的影响

3.2.3.Eupergit C的用量对固定化酶活的影响

3.2.4.Eupergit C固定化苹果氧腈酶的酶活

3.2.5.Eupergit C固定化苹果氧腈酶的酶漏检测

3.2.6.固定化苹果氧腈酶与游离酶催化性能的比较

3.2.7.Eupergit C固定化苹果氧腈酶循环催化5-苯并噻吩甲醛手性羟腈化

3.2.8.Eupergit C固定化苹果氧腈酶循环催化其它底物手性羟腈化

参考文献

第五章固定化HbHNL催化合成手性药物中间体的研究

1.引言

2.磁性微球固定化HbHNL

2.1.试剂与仪器

2.1.1.试剂

2.1.2.仪器

2.2.方法

2.3.结果与讨论

2.3.1.磁性微球的特性

2.3.2.磁性微球固定化HbHNL酶漏检测

2.3.3.放置时间对磁性微球固定化HbHNL酶活的影响

2.3.4.磁性微球固定化HbHNL与游离酶催化性能的比较

2.3.5.磁性微球固定化HbHNL循环催化3,4-亚甲二氧基苯甲醛手性羟腈化

2.3.6.磁性微球固定化HbHNL循环催化其它底物手性羟腈化

3.磁性微球固定化HbHNL介导的一次生物转化制备两种手性分子

3.1.试剂与方法

3.1.1.试剂

3.1.2.方法

3.2.结果与讨论

4.对3,4-亚甲二氧基苯丙酮手性羟腈化的进一步讨论

4.1.方法

4.2.结果与讨论

4.2.1.不同pH值时非酶促反应的收率

4.2.2.不同有机溶剂对3,4-亚甲二氧基苯丙酮手性羟腈化的影响

4.2.3.酶制剂的种类对3,4-亚甲二氧基苯丙酮手性羟腈化的影响

4.2.4.丙酮氰醇与磁性微球固定化HbHNL的用量对反应的影响

参考文献

第六章新氧腈酶源的探索和产氧腈酶微生物的筛选

1.引言

2.植物中新酶源的探寻

2.1.Guazuma ulmifolia（Sterculiaceae）and Ostrya virginiana（Betulaceae）

2.2.Ryparosa kurrangii（Achariaceae）

2.3.CsHNL催化反应的进一步研究

3.产氧腈酶微生物的筛选

3.1.仪器与试剂

3.1.1.仪器

3.1.2.试剂

3.2.材料与培养基

3.2.1.土壤样品

3.2.2.培养基

3.3.方法

3.4.结果与讨论

3.4.1.氧腈酶活的初步检测

3.4.2.菌种的初步鉴定

3.4.3.氧腈酶对映体选择性检测

4.F-901菌株产酶条件的研究

4.1.材料与方法

4.1.1.培养基

4.1.2.方法

4.2.结果与讨论

4.2.1.碳源的影响

4.2.2.氮源的影响

4.2.3.温度和初始pH值的影响

参考文献

总结

致谢

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论文2

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