桃遗传转化再生体系的建立及果实特异性基因E8启动子的克隆

论文摘要

桃〔Prunuspersica （L.） Batsch〕是重要的商品化核果类果实,世界年产量超过一千三百万吨。我国是桃主产国,产量位居世界各国之首,甘肃省是桃的发源地和最适栽培区之一,也是极具发展潜力的地方农业特色资源。桃果色、香、味、质俱佳,很受消费者欢迎,在果品市场占据重要地位。然而,桃是典型的乙烯跃变型果实,果实采后迅速软化,大多数品种成熟季节又适逢高温高湿,果实极易腐烂变质,严重影响其销售与贮运,这是长期制约桃生产的主要问题之一。延长桃贮藏期常采用的低温冷藏等方法,易造成桃果冷害,结果并不十分理想。桃贮藏保鲜的现实证明延长贮藏时间、提高贮藏品质,延长货架期,减少采后腐烂等问题已不能完全依靠常规措施解决,通过改善贮藏的方式方法来调节桃子市场供应时间是十分困难的。因此,通过生物技术控制果实软化,从根本上改变桃的贮运性能具有重要的生产意义。本研究以甘肃省三个常栽品种种胚为试材,建立了桃遗传转化再生体系,并以番茄品种“毛粉802”为试材,克隆了果实特异性E8启动子,为进一步利用转基因技术选育耐储性硬溶质桃新种质奠定必要的研究基础。取得如下主要研究结果:1.以白粉桃、雨花露桃、广山白桃幼叶、叶柄、幼茎及花后50d至完全成熟的果实种胚为外植体进行组织培养,建立桃遗传转化再生体系。结果表明:（1）桃不同外植体均能诱导出愈伤组织,但花后50d以后的种胚诱导愈伤组织分化不定芽的效果最好。其最佳愈伤组织诱导培养基为MS + 6-BA 0.25 mg·L -1 + 2,4-D 1.0 mg·L -1,三品种平均诱导频率可达99.8%。（2）蔗糖对胚愈伤组织增殖的效果明显,在MS + 6-BA 0.1mg·L -1 + NAA 1.0 mg·L -1增殖培养基上,以20 mg·L -1蔗糖对愈伤组织增殖的效果最好,增殖倍数可达10.16,且多为分化能力较高的颗粒状愈伤组织。（3）将愈伤组织转接在MS + 6-BA 1.0mg·L -1 + NAA 0.1mg·L -1分化培养基上,愈伤组织向胚性愈伤组织转化,三品种花后50d的未成熟胚平均不定芽分化率最高,为37.5%。（4）将不定芽用100mg·L -1 IBA浸蘸其基部转移到不含激素的1/2MS培养基中诱导生根,生根率为82%。（5）花后75d以后的种胚均能在MS + 6-BA 0.5mg·L -1 + NAA 0.05 mg·L -1的培养基上直接诱导分化成苗。其中花后75d的白粉桃未成熟胚的分化频率可达96.1%,高于其他两品种。以上结果表明:利用花后50～60d的未成熟胚经愈伤组织诱导分化不定芽与利用花后75d以后的大龄胚胚培养直接分化成苗两种方式均可建立桃的遗传转化再生体系。2.采用改进的CTAB法提取番茄基因组DNA,得到的DNA纯度最高,效果最好,DNA溶液多糖含量少且无褐化现象,适于后续的分子生物学操作。设计合成了带有HindⅢ、BamHⅠ特定酶切位点的一对特异引物,优化了PCR反应体系。通过PCR扩增获得了1.1kb的E8启动子基因片段,将其克隆到质粒载体pMD18-T Simple Vector中,经PCR、双酶切鉴定,均获得1.1kb预期大小的片段。表明E8果实特异性启动子基因片段已正确插入pMD18-T Simple Vector载体中。得到了重组子pMD-E8。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略词表
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 桃延熟保鲜研究进展
• 1.1 桃果实软化变质的影响因素
• 1.1.1 水解酶类
• 1.1.2 贮藏条件
• 1.1.3 植物激素
• 1.2 延长果实保鲜期的基因工程研究进展
• 1.2.1 利用S-腺苷甲硫氨酸水解酶基因延长果实保鲜期
• 1.2.2 利用ACC 合成酶和ACC 氧化酶基因延长果实保鲜期
• 1.2.3 利用ACC 脱氨酶基因延长果实保鲜期
• 1.2.4 利用多聚半乳糖醛酸酶基因（PG）延长果实保鲜期
• 1.2.5 利用其他基因延长果实保鲜期
• 2 植物基因启动子
• 2.1 植物基因启动子的一般特征
• 2.1.1 转录起始位点
• 2.1.2 TATA 盒
• 2.1.3 G 盒保守序列
• 2.2 植物基因启动子的类型
• 2.2.1 组成型启动子
• 2.2.2 组织特异性启动子
• 2.2.3 诱导型启动子
• 2.2.4 双向启动子
• 2.2.5 可变启动子
• 2.3 启动子的应用
• 2.3.1 组成型启动子的应用
• 2.3.2 组织特异启动子的应用
• 2.3.3 诱导型启动子的应用
• 2.4 已经分离克隆到的启动子及其表达特性
• 2.5 植物果实特异性启动子研究进展
• 2.5.1 E8 启动子
• 2.5.2 2A11/2A12 启动子
• 2.5.3 PG 启动子
• 2.5.4 MCPI 启动子
• 2.5.5 B33 启动子
• 2.5.6 ACC 氧化酶启动子
• 3 桃组织培养和离体转化研究进展
• 3.1 组织培养
• 3.1.1 外植体类型
• 3.1.2 愈伤组织的诱导与不定芽的分化
• 3.1.3 生根培养
• 3.2 遗传转化
• 3.2.1 农杆菌介导法转化桃
• 3.2.2 基因枪轰击法转化桃
• 第二章 桃遗传转化再生体系的建立
• 1 桃遗传转化再生体系的建立技术路线
• 2 实验材料
• 2.1 材料
• 2.2 试剂
• 2.3 激素配置
• 2.4 培养基
• 2.5 实验仪器
• 3 实验方法
• 3.1 外植体的采集与消毒
• 3.2 培养条件
• 3.3 愈伤组织诱导
• 3.3.1 不同诱导培养基与不同品种对胚愈伤组织诱导的影响
• 3.3.2 不同胚龄胚对愈伤组织诱导的影响
• 3.3.3 不同外植体愈伤组织诱导效果
• 3.4 愈伤组织增殖
• 3.4.1 不同蔗糖浓度对胚愈伤组织增殖的效果
• 3.5 不定芽的分化与植株再生
• 3.5.1 激素配比对胚愈伤组织不定芽分化的影响
• 3.5.2 不同胚龄胚对愈伤组织不定芽再分化能力的影响
• 3.6 种胚直接诱导不定芽再生
• 3.7 实验数据统计
• 4 结果与分析
• 4.1 不同诱导培养基与不同品种对胚愈伤组织诱导的影响
• 4.2 激素对胚愈伤组织出愈率的影响
• 4.3 不同胚龄胚对愈伤组织诱导的影响
• 4.4 不同外植体愈伤组织诱导效果
• 4.5 不同蔗糖浓度对胚愈伤组织增殖的效果
• 4.6 激素配比对胚愈伤组织不定芽分化的影响
• 4.7 不同胚龄胚对愈伤组织不定芽再分化能力的影响
• 4.8 不同胚龄胚直接分化再生植株的能力
• 4.9 不定芽生根的诱导
• 5 讨论
• 第三章 果实特异性E8 启动子的基因克隆
• 1 E8 启动子的基因克隆技术路线
• 2 实验材料
• 2.1 材料
• 2.2 试剂
• 2.3 质粒
• 2.4 菌株
• 2.5 引物设计
• 2.6 有关试剂及溶液配置
• 2.6.1 主要溶液
• 2.6.2 主要培养基
• 2.7 实验仪器
• 3 实验方法
• 3.1 番茄幼苗的培养
• 3.2 基因组DNA 提取
• 3.2.1 高盐低pH 值法
• 3.2.2 分步离心法
• 3.2.3 SDS 法
• 3.2.4 CTAB 法
• 3.2.5 本试验提取DNA 所用方法
• 3.2.6 琼脂糖凝胶电泳
• 3.3 目的基因的PCR 扩增
• 3.3.1 PCR 反应体系优化
• 3.3.2 PCR 扩增程序筛选
• 3.3.3 PCR 扩增产物的凝胶电泳观察
• 3.4 目的DNA 片段回收
• 3.5 目的片段的连接
• 3.6 感受态E.coli DH5α细胞的制备
• 3.7 E.coli DH5α的转化
• 3.8 重组子的筛选与鉴定
• 3.8.1 β-半乳糖苷基因插入失活筛选
• 3.8.2 碱裂解法小量提取质粒DNA
• 3.8.3 滞后质粒筛选
• 3.8.4 重组子的PCR 鉴定
• 3.8.5 重组子的Hind Ⅲ、BamH Ⅰ双酶切鉴定
• 3.8.6 重组子阳性克隆菌保存
• 4 实验结果及分析
• 4.1 基因组DNA 提取方法比较
• 4.2 PCR 反应体系优化结果
• 4.3 重组子滞后质粒筛选
• 4.4 滞后质粒PCR 鉴定
• 4.5 滞后质粒双酶切鉴定
• 5 讨论
• 5.1 启动子的选择
• 5.2 β-半乳糖苷基因插入失活的蓝白菌落筛选
• 第四章 结论
• 附图
• 致谢
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介