植物乳杆菌ZS2058中亚油酸异构酶的分离纯化及其酶学性质的研究

论文摘要

共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid, CLA）是亚油酸（Linoleic Acid, LA）衍生的共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。它具有多种营养和保健功能,如抗癌、抗动脉粥样化和延缓机体免疫力衰退、减肥等。在共轭亚油酸的各种异构体中c9, t11-CLA被认为最具有生物活性。利用乳酸菌进行生物转化共轭亚油酸由于反应条件温和,产物异构体较单一,以及易于操作和控制,成为了当前生物转化共轭亚油酸领域的一个研究热点。而亚油酸异构酶作为乳酸菌生物转化共轭亚油酸的一个关键酶,近来也成为了研究的一个焦点。植物乳杆菌ZS2058是本实验室从泡菜中筛选到的一株具有亚油酸异构酶活性的乳酸菌。采用超声波破碎和溶菌酶消化相结合的方法来对植物乳杆菌ZS2058中的亚油酸异构酶进行提取,超声波法提取该亚油酸异构酶的最佳条件是:破碎功率400W,破碎时间7.5min （破碎5s,间歇9s）。通过对细胞破碎液进行差速离心分级沉淀,将收集到的不同组分进行酶活检测,发现膜沉淀组分中的亚油酸异构酶活性占所有组分总酶活的70%。因此,该亚油酸异构酶为膜结合蛋白。又通过研究Triton X-100和NaCl对该亚油酸异构酶粗酶液活性的影响,进一步证实了该亚油酸异构酶为膜结合蛋白,而且是一种膜内在蛋白。对亚油酸异构酶粗酶性质的研究发现,底物LA浓度对亚油酸异构酶活性的影响非常显著,当亚油酸的浓度高于0.08mg/mL时,亚油酸异构酶的活性会受到很明显的抑制;而加入5%的甘油则能增强粗酶液中亚油酸异构酶的稳定性。本文对该亚油酸异构酶的分离纯化进行了研究。硫酸铵分级沉淀的硫酸铵饱和度适宜取值范围为20%-50%;阴离子交换层析采用梯度洗脱的方法,当缓冲体系Tris-HCl缓冲液（20mM,1%Triton X-100,5%甘油）的pH值为9.0时,亚油酸异构酶在NaCl浓度为0.12M处被洗脱下来,并获得了较好的纯化效果。亚油酸异构酶粗酶液经硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析后,得到了电泳纯的亚油酸异构酶,纯化倍数为8.49倍,比酶活为168.58U/mg。经SDS-PAGE分析,该亚油酸异构酶的分子量约为66kDa。本文又对纯化后的亚油酸异构酶的酶学性质进行了研究。研究结果表明,该亚油酸异构酶的最适温度为35℃,最适pH为5.5;该亚油酸异构酶的耐热性较差;多种金属离子对亚油酸异构酶活性的影响均不显著;金属螯合剂EDTA和EGTA对亚油酸异构酶活性的影响不显著;多种辅酶因子对亚油酸异构酶活性的影响也不显著;通过采用Lineweaver-Burk双倒数法求得该亚油酸异构酶的动力学参数Km=2.15×10-5mol/L,Vmax=3.71×10-9mol/ （min?mg）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 共轭亚油酸概况
• 1.1.1 共轭亚油酸
• 1.1.2 CLA 的检测方法
• 1.2 微生物转化法合成CLA
• 1.2.1 生物转化CLA 的研究进展
• 1.2.2 亚油酸异构酶的研究进展
• 1.3 立题意义
• 1.4 主要研究内容
• 第二章 植物乳杆菌ZS2058 中亚油酸异构酶的定位及其粗酶性质的初步研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 菌种
• 2.2.1.2 培养基
• 2.2.1.3 主要试剂
• 2.2.1.4 主要仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 底物亚油酸的制备
• 2.2.2.2 亚油酸乳浊液的制备
• 2.2.2.3 菌种培养
• 2.2.2.4 亚油酸异构酶粗酶液的制备
• 2.2.2.5 酶活的测定
• 2.2.2.6 脂肪酸提取
• 2.2.2.7 气相色谱法检测共轭亚油酸
• 2.2.2.8 紫外分光光度法检测共轭亚油酸
• 2.2.2.9 蛋白含量的测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 尿素包埋法制备亚油酸
• 2.3.2 超声波对亚油酸异构酶提取效果的影响
• 2.3.2.1 超声波破碎功率对亚油酸异构酶提取效果的影响
• 2.3.2.2 超声波破碎时间对亚油酸异构酶提取效果的影响
• 2.3.2.3 植物乳杆菌ZS2058 破碎效果的检测
• 2.3.3 亚油酸异构酶的定位
• 2.3.4 去垢剂Triton X-100 提取对粗酶液中亚油酸异构酶活性的影响
• 2.3.5 NaCl 对粗酶液中亚油酸异构酶活性的影响
• 2.3.6 底物LA 浓度对粗酶液中亚油酸异构酶活性的影响
• 2.3.7 甘油对粗酶液中亚油酸异构酶活性的影响
• 2.4 本章小结
• 第三章 植物乳杆菌ZS2058 中亚油酸异构酶的分离纯化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 菌种
• 3.2.1.2 培养基
• 3.2.1.3 主要试剂
• 3.2.1.4 主要仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 菌种培养
• 3.2.2.2 粗酶液的制备
• 3.2.2.3 硫酸铵分级沉淀
• 3.2.2.4 酶液的透析脱盐
• 3.2.2.5 酶液的浓缩
• 3.2.2.6 阴离子交换层析
• 3.2.2.7 凝胶过滤层析
• 3.2.2.8 电泳分析
• 3.2.2.9 酶活的测定
• 3.2.2.10 蛋白含量的测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 硫酸铵分级沉淀
• 3.3.2 阴离子交换层析
• 3.3.3 凝胶过滤层析
• 3.3.4 气相色谱法鉴定各纯化步骤组分中亚油酸异构酶的活性
• 3.3.5 电泳分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 植物乳杆菌ZS2058 中亚油酸异构酶酶学性质的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.1.1 菌种
• 4.2.1.2 培养基
• 4.2.1.3 主要试剂
• 4.2.1.4 主要仪器
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 菌种培养
• 4.2.2.2 亚油酸异构酶溶液的制备
• 4.2.2.3 酶活的测定
• 4.2.2.4 温度对亚油酸异构酶活性的影响
• 4.2.2.5 pH 对亚油酸异构酶活性的影响
• 4.2.2.6 亚油酸异构酶的热稳定性
• 4.2.2.7 金属离子对亚油酸异构酶活性的影响
• 4.2.2.8 金属螯合剂对亚油酸异构酶活性的影响
• 4.2.2.9 辅酶因子对亚油酸异构酶活性的影响
• 4.2.2.10 亚油酸异构酶动力学参数Vmax 和Km 的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 温度对亚油酸异构酶活性的影响
• 4.3.2 pH 对亚油酸异构酶活性的影响
• 4.3.3 亚油酸异构酶的热稳定性
• 4.3.4 金属离子对亚油酸异构酶活性的影响
• 4.3.5 金属螯合剂对亚油酸异构酶活性的影响
• 4.3.6 辅酶因子对亚油酸异构酶活性的影响
• max和K_m 的测定'>4.3.7 亚油酸异构酶动力学参数V_max和K_m的测定
• 4.4 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文