登革病毒感染湿热证小鼠模型建立及清热祛湿法作用机理探讨研究

论文摘要

一、研究背景和目的登革病毒（DV）属黄病毒科黄病毒属,是一种由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播的单股正链RNA病毒,可以引起登革热（DF）、登革出血热（DHF）以及登革休克综合征（DSS）。近年来,由于全球气候变暖,蚊媒分布区域扩大,登革病毒感染流行呈不断上升的趋势,已发展成为威胁人类生命健康的重大公共卫生问题。遗憾的是,登革病毒致病机理、抗病毒药物或疫苗研究一直进展缓慢,其中一个重要难点在于没有合适的动物模型,因此无法直接对致病因子、疫苗或药物进行验证。近年来,“病证结合”的模型已成为动物模型发展的新趋势,将西医学的“病”（即病因或病理）、中医学的“证”同时考虑制备出的动物模型具有客观性强、可信度高而且更贴近临床等特点。在此思路上,本研究尝试构建登革热的病证结合动物模型。值得注意的是,中医学中并无“登革热”这一病名,其属于中医温病范畴,根据其发病情况和症状特点,可分属于“湿热疫”和“暑燥疫”。而本病多发于岭南,该地区的气候特点多湿多热,由此认为此病乃外感湿热,内伤脾胃所致,与“湿热证”关系密切。在此基础上,本研究用高温舱模拟岭南高温高湿环境,根据中医温病湿热证方法[高糖高脂饲料+感染因子（DV）]造模,旨在建立登革病毒感染的湿热证小鼠模型。目前国内多用BALB/C小鼠感染造模,而近几年,陈萱静等采用C57BL/6小鼠成功构建登革出血热和肝损伤模型。为此,本实验用BALB/C和C57BL/6两种小鼠进行研究,同时采用不同的攻毒（单次DV2攻击、模拟ADE攻击）和热暴露方式（热损伤、热习服）,探讨不同鼠种、攻毒模式和热暴露方式等复合因素造模的效果,以期寻求较为理想的登革病毒感染湿热证小鼠模型,为一步揭示登革病毒的致病机理奠定基础。中医温病湿热证模型的应用基础研究内容分两部分：一是建立湿热证动物模型；二是进行清热祛湿法的机理研究。实验后期在筛选出理想模型的基础上,可通过中药治疗来反证模型。运用清热祛湿法（蒿芩清胆汤）对其治疗,同时与清瘟败毒法、利巴韦林（西药类抗病毒药物）以及安慰剂进行比较。探讨清热祛湿法对模型疗效及其可能的作用机理,更深入研究其分子机制上的作用靶点（湿热证与水通道蛋白的关系）。为阐明清热祛湿法的作用机理奠定基础。二、研究方法1、登革病毒的培养及登革2型病毒（NGC株）荧光定量PCR标准曲线的建立：用C6/36细胞和乳鼠培养登革病毒。将含DV2基因组cDNA片段的重组质粒经过10倍系列稀释后,进行荧光定量PCR反应得到相应的扩增曲线和标准曲线。2、登革热湿热证小鼠模型的建立：根据不同鼠种（BALB/C和C57BL/6小鼠）、不同攻毒模式（单次DV2攻击、模拟ADE攻击）和不同热暴露方式（热损伤、热习服）三个因素分组,按照排列组合原则,需8个造模组。同时设正常组、单纯DV2感染组、单纯湿热条件组做对照,共分为14组。观察造模后小鼠体温、症状、体征,检测血小板（PLT）、肝功能（ALT、AST）、血脂（TG、CHOL）等指标,组织病理学观察肝脏变化,荧光定量PCR检测血清中病毒滴度等来综合评价造模效果,筛选出最佳登革病毒感染的湿热证小鼠模型。3、不同药物对模型治疗比较及清热祛湿法机理探讨：按实验2筛选出的最佳模型造模,将动物随机分为5组：模型组、蒿芩清胆汤组、清瘟败毒饮组、病毒唑组、生理盐水组,同时设正常对照组。观察各组实验小鼠体温、症状、体征,检测血小板（PLT）、肝功能（ALT、AST）、血脂（TG、CHOL）和肝脏病理,以及脑水通道蛋白4（AQP4）、肾水通道蛋白2（AQP4）、胃水通道蛋白4（AQP4）等指标。比较不同药物的治疗作用,探讨清热祛湿法的治病机理。三、研究结果1、登革病毒培养及标准曲线建立：登革病毒颅内接种乳鼠,约7天后发病,表现为拒乳、离群、行动迟缓、弓背、侧卧、双下肢麻痹或抽搐等症状。C6/36细胞接种病毒,约5-7天90%的细胞出现CPE现象,表现为细胞聚集、细胞脱落或出现空泡。根据质粒进行荧光定量PCR反应,根据扩增曲线得到相应的标准曲线方程：Y=-3.576logX+52.23。斜率为-3.576,E为0.94,说明扩增效率良好。相关系数：R2=1.0>0.99,说明起始模板浓度倍数的对数值与Ct值有较好的线性相关性。2、造模后小鼠一般表现：小鼠经病毒攻击后活动明显减少,对外界刺激反应慢,毛发耸立不顺,饮食、饮水量减少,小便较臭、大便较正常组软。进入气候仓后开始烦躁不安,活动增加,食量减少,饮水增多,渐渐至倦卧,对刺激反应慢,多次放入气候仓后形成热习服,则与正常小鼠无明显差异。BALB/C和C57BL/6小鼠间相差不大,各组小鼠体温组间差异也无统计学意义。蒿芩清胆汤对改善造模组症状有一定作用。3、模型主要指标的检测：造模后小鼠PLT降低,ALT、AST升高,尤以AST升高显著。高脂饲料喂养的小鼠TG、CHOL升高。病毒攻击的小鼠组荧光定量PCR检测到病毒。蒿芩清胆汤有降低ALT、AST和TG、CHOL的作用,清瘟败毒饮对降低的PLT有提升作用。4、复合因素造模后,模型组脑组织AQP4的表达增强,胃粘膜AQP2的表达增强；而肾内AQP2的表达减弱；蒿芩清胆汤有逆转上述表达的作用,使之回调,与其余各组相比,差异有统计学意义。5、肝脏病理变化：各造模组均有不同程度病理变化：肝细胞轻到重度水肿；个别细胞嗜酸性变；肝细胞点状、小灶状坏死,坏死区较多炎细胞浸润。单纯病毒组表现稍轻,单纯湿热组仅见肝细胞轻度肿胀,蒿芩清胆汤治疗后肝脏病理变化有所好转。四、结论动物模型符合登革热病的特点,未改变登革热模型的关键指标,同时模型小鼠出现明显湿热证客观指标的变化,成功建立了登革病毒感染的湿热小鼠模型。综合症状、血清病毒滴度、肝功能损害以及血脂等指标多方面衡量各个模型组,以BALB/C+DV2+热损伤组造模效果最佳,最能体现登革热湿热证的特点。蒿芩清胆汤对以上的登革病毒湿热证模型有治疗作用,能改善症状,下调血脂,保护肝功能改善肝脏病理损害,调整失常的水通道蛋白。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 登革病毒的培养及登革2型病毒荧光定量PCR标准曲线的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第二章 登革病毒感染湿热证小鼠模型建立及评价
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三章 不同药物对登革热小鼠模型干预作用比较及机理探讨
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 附录
• 硕士期间成果
• 致谢
• 统计学合格证明