猪圆环病毒PCR-RFLP分型方法的建立及其国内流行毒株的遗传变异分析

论文摘要

猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2, PCV2）是近些年来对养猪业危害最严重的病毒之一,主要包括断奶猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS）、断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病（Porcine Respiratory Disease complex, PRDS）、猪皮炎和肾炎综合征（Porcine Dernmatis and Nephropathy Syndrome, PDNS）、幼龄仔猪A2型先天性震颤（Congenital Tremors, CT）、间质性肺炎（Interstitial Pneumonitis, IP）、增生性坏死性肺炎（Proliferation Necrotizing Pneumonia, PNP）等。PCV2的感染能降低猪体免疫力,常引起其他病原微生物的继发并发感染,加重病情。自1982年命名以来,发展迅速,在世界许多国家和地区广泛流行,给世界养猪业造成巨大的经济损失,严重影响着世界养猪业的发展。我国很多地区也陆续报道有PCV2流行,黑龙江省有PCV2感染的疑似病例,黑龙江省兽医卫生防疫站的张加勇等已经对黑龙江省内的6个地（市）十个种猪场进行了PCV2血清学调查,但尚无病原学诊断的证据,为了为PCV2的实验室诊断提供一种可靠的病原学检测方法,本研究旨在建立一种快速、方便的PCV的PCR-RFLP分型方法适用于现地检测。通过对GenBank中公布的8株PCV2和8株PCV1基因组全序列的比较分析,设计一对PCV2特异引物,含有特异性酶切位点EcoR I和一对PCV1特异引物,含有特异性酶切位点Hinc II;两对引物均含ORF2。建立了一种快速检测PCV1和PCV2的敏感、特异、重复性好的PCR-RFLP鉴别诊断方法,应用本方法对对国内部分地区的PCV2分离株的ORF2遗传变异情况进行了分析,9株PCV2的ORF2基因核酸序列同源性比较,同源性大于97%,在进化树上与国内的分离株处于同一分支上,关系最近;PCV2的ORF2呈现一定的地域性和相对的稳定性。在发病猪病料中检测到2株PCV1,实验室保存的PK-15细胞检测到1株PCV1,并进行了全基因组的测序:J5-PCV1 1758bp;G1-PCV1 1759bp;Wen-PCV1 1759bp。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 病原简介
• 1.2 流行病学现状
• 1.3 临床观察与病理损伤
• 1.4 诊断方法研究
• 1.4.1 PCR 诊断技术
• 1.4.2 间接免疫荧光试验
• 1.4.3 免疫组化法
• 1.4.4 核酸探针及原位杂交
• 1.4.5 免疫过氧化物酶单层细胞试验
• 1.4.6 酶联免疫吸附试验
• 1.5 疫苗研究
• 1.6 防制研究
• 1.7 问题与展望
• 1.8 本研究的目的意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒与细胞
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 猪圆环病毒PCR-RFLP 分型方法的建立
• 2.2.2 病毒的分离
• 2.2.3 国内部分地区PCV 分子流行病学调查
• 2.2.4 部分猪场PCV2 ORF2 的克隆与序列分析
• 2.2.5 PCV1 分离株全基因组的克隆
• 3. 结果与分析
• 3.1 猪圆环病毒PCR-RFLP 分型方法的建立
• 3.1.1 PCR 扩增
• 3.1.2 温度梯度试验
• 3.1.3 特异性试验
• 3.1.4 敏感性试验
• 3.1.5 限制内切酶多态性分析
• 3.1.6 PCR 扩增条件的优化
• 3.2 病毒的分离
• 3.2.1 PCR 检测
• 3.2.2 间接免疫荧光方法鉴定PCV 分离株
• 3.2.3 电镜观察
• 3.2.4 分离株的序列分析
• 3.3 国内部分地区PCV 分子流行病学调查
• 3.4 部分猪场PCV2 ORF2 核苷酸及推导氨基酸序列分析
• 3.5 PCV1 分离株全基因组的克隆
• 3.5.1 PCV1 分离株的PCR 扩增
• 3.5.2 重组质粒的酶切鉴定
• 3.5.3 PCV1 分离株的序列分析
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文