论文摘要
兴奋性突触突触后亲离子型谷氨酸受体主要是AMPA（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate，AMPA）受体和NMDA（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体，二者协同完成兴奋性突触的传递和介导复杂的生理功能。已知NMDA受体与许多复杂的生理和病理机制有关，如突触的可塑性、长时程增强作用（LTP）、学习和记忆、兴奋性神经毒性、神经退行性变性疾病等。已克隆到7个编码NMDA受体亚单位蛋白的基因，即NR1、NR2A-2D和NR3A，3B。其中NR1为一个独立的基因，但可产生8个剪接变体；NR2现共有4个相关的基因，NR2A、NR2B、NR2C和NR2D；NR3现则有2个基因，分别为NR3A和NR3B。重组受体的研究表明：NR1亚单位是NMDA受体复合物的必需组分，而不同的NR2亚单位则可与NR1形成具有不同通道特征的NMDA受体复合物。NMDA受体普遍认为是由NR1和NR2亚单位组成的异四聚体。目前关于NMDA受体的功能性研究已经非常深入，但是，NMDA受体装配的选择性调控机制还不是很清楚。而且还没有找到特定NMDA受体各亚基上控制形成同聚或者异聚体的区域。先前有研究报道，NMDA亚单位的N末端对于受体的装配有主要作用。该实验是建立在免疫共沉淀的方法之上，尽管实验技术比较成熟，但是，由于要经过细胞裂解搜集等步骤常常不能反映生理情况，或者不能用于活细胞的观测。近年来一种新的荧光技术——荧光共振能量转移（FRET）被广泛地应用到受体装配的研究，该方法可以检测距离在10nm之内的蛋白之间的相互作用，而受体亚单位复合物之间的距离已被普遍认为在此范围之内，而且该技术可以实现活细胞内的实时观测，我们实验室利用此方法，通过N端不同区域截短的实验发现，N端在NMDA受体亚单位同聚体和异聚体装配中并不起到决定性的作用。为了更进一步的研究NMDA受体N末端对受体装配的作用，我们首先选择了NR1亚单位，因为不同的NR1剪接变体也赋予NMDA受体通道不同的功能特征，而且NR1广泛表达于各个脑区，是NMDA受体通道的必要组成成分，有一定的代表性。然后构建了NR1与GluR2的N末端不同区域（ATD，S1，以及NT）的嵌合体，包括：XFP-NR1-ATD-GluR2，XFP-NR1-S1-GluR2，XFP-NR1-NT-GluR2。经酶切和测序鉴定确定构建物的正确性，进一步转染HEK293细胞证实这些CFP和YFP标记的受体亚单位具有良好的荧光信号。以这些表达载体为工具，结合活细胞表面受体免疫染色技术和荧光能量转移技术，我们进一步观察了这些嵌合体之间，或者与野生型NR1，NR2亚单位的装配，膜表面表达情况，获得了如下研究结果：（1）为了研究NR1a亚单位N末端是否存在协同NR2B亚单位到达膜表面的功能区，将XFP-NR1-ATD-GluR2，XFP-NR1-S1-GluR2 XFP-NR1-NT-GluR2，分别与NR2B共转染到HEK293细胞中去，然后采用抗GFP抗体和Cy3交联的二抗对转染细胞作活细胞表面染色，结果发现这些嵌合体都不能获得表面表达。同时，全细胞式电生理记录这些嵌合体与NR2B共转染的HEK293细胞，也未能记录到NMDA受体电流。这些结果提示NR1a亚单位N末端能帮助NR1a／NR2B获得表面表达。而替换为同源型较高的GluR2亚单位并不能使得其表面表达。（2）为了探究是否CFP-NR1-NT-GluR2，YFP-NR1-NT-GluR2能在细胞内形成同聚体，将其共转染到HEK293细胞中去，然后用活细胞荧光成像技术，检测其三通道荧光值计算荧光能量转移情况，发现其能在细胞内部形成同聚体。在CFP-NR1-ATD-GluR2，YFP-NR1-ATD-GluR2，CFP-NR1-S1-GluR2，YFP-NR1-S1-GluR2两组共转染时也发现了类似的结果。这可能提示NR1a嵌合体彼此之间可以借助NR1片段之间的或嵌入的GluR2片段之间的相互作用可以很好地装配。同时我们还发现，CFP-NR1-NT-GluR2可以与野生型NR1或NR2B亚单位装配，这进一步提示NR1a嵌合体的构建本身不影响亚单位的膜拓朴学结构，同时也提示NR1的N末端对于NMDA受体的装配没有决定性作用。