建立免疫亲和柱联合高效液相色谱法检测苏丹红Ⅰ

论文摘要

本研究采用环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶4FF （Sepharose 4FF）,通过ε-氨基己酸（AHA）修饰,获得免疫亲和基质,并与抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体偶联,制备苏丹红Ⅰ免疫亲和柱,同时建立了免疫亲和柱联高效液相色谱法（Immunoaffinity column-High Performance Liquid Chromatography, IAC-HPLC）检测辣椒粉加标样品中的苏丹红Ⅰ。研究结果如下：1琼脂糖凝胶Sepharose 4FF的活化与修饰采用环氧氯丙烷法活化Sepharose 4FF,对Sepharose 4FF预处理、反应温度、反应时间、DMSO百分比、NaOH浓度和环氧氯丙烷百分比分别进行优化,确定了40℃反应2 h 20 min、46.8% DMSO、30% ECH和NaOH初始浓度为8 mol/L、终浓度为0.8 mol/L为最佳反应条件,在此条件下,环氧基活化率能到达80μmol/g。采用ε-氨基己酸为间隔臂修饰环氧氯丙烷法活化的Sepharose 4FF （Sepharose 4FF-epoxy）,确定了以pH 8.30.1 mol/L NaHCO3含0.5 mol/L NaCl、25℃偶联8.5 h为最佳反应条件。2 Sepharose 4FF-epoxy-s-氨基己酸与配体的偶联反应将Sepharose 4FF-epoxy-s-氨基己酸与氨基化苏丹红反应,对反应条件EDAC浓度、反应温度和时间进行优化,确定了以EDAC浓度为19mg/mL、27℃、16h为最佳反应条件。氨基与羧基偶联过程中,考虑到温度过高会造成抗体活性的破坏,在4℃条件下,进一步优化,确定了以EDAC浓度为19mg/mL、反应72h为最佳反应条件。3抗SudanⅠ单克隆抗体免疫亲和柱的制备将辛酸-硫酸铵法纯化的抗SudanⅠ单克隆抗体与ε-氨基己酸修饰的琼脂糖凝胶Sepharose 4FF偶联。采用HPLC方法检测免疫亲和柱的柱容量。抗Sudan I单克隆抗体免疫亲和柱以0.3 g带羧基的琼脂糖凝胶4FF与1 mg苏丹红Ⅰ单抗偶联,柱容量为1.6μg。4建立IAC-HPLC检测苏丹红Ⅰ将苏丹红Ⅰ样品过免疫亲和柱,乙腈洗脱后以高效液相色谱法（HPLC）检测,紫外检测波长为478 nm,流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈-0.1%甲酸乙腈溶液-丙酮（体积比为21.25：3.75：60：15）。对免疫亲和柱的操作条件即上样缓冲液、上样方式、洗脱液体积进行优化,并对免疫亲和柱的稳定性进行了测定。结果显示以20%乙腈-PBS、上样一次、3 mL乙腈洗脱液为最佳条件。在加标实验中,辣椒粉以0.25～3mg/kg水平添加SudanⅠ标准品,平均回收率为44.52%-77.40%,相对标准偏差为4.6%-8.3%,最低检出限为125ng/mL。

论文目录

• 缩略语
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1.1 苏丹红的性质与危害
• 1.2 苏丹红检测方法的研究进展
• 1.2.1 薄层色谱法（TLC）
• 1.2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.2.3 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.2.4 其他方法
• 1.3 苏丹红纯化方法的研究进展
• 1.3.1 样品中苏丹红的提取
• 1.3.2 苏丹红提取液的净化
• 1.4 免疫亲和柱制备的研究
• 1.4.1 抗体的获得
• 1.4.2 载体的选择和活化
• 1.4.3 抗体或抗原与载体偶联
• 1.4.4 免疫亲和介质的装柱和样品的净化
• 1.5 免疫亲和柱的应用
• 1.5.1 免疫亲和柱与其他分析技术联用
• 1.5.2 IAC在真菌毒素检测中的应用
• 1.5.3 IAC在农药残留检测中的应用
• 1.5.4 IAC在兽药残留检测中的应用
• 1.5.5 IAC在筛选药物有效成分研究中的应用
• 1.5.6 IAC在特异性去除高丰度蛋白中的应用
• 1.6 主要研究内容、目的和意义
• 1.6.1 本研究的目的和主要研究内容
• 1.6.2 本研究的意义
• 第二章 苏丹红免疫亲和柱的制备
• 2.1 仪器与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.1.3 试剂与溶液的配制
• 2.2 实验方法与步骤
• 2.2.1 Sepharose 4FF的活化
• 2.2.2 氨基化苏丹红的制备
• 2.2.3 建立酶联免疫吸附试验检测苏丹红
• 2.2.4 抗苏丹红免疫亲和柱的制备
• 2.2.5 建立免疫亲和柱联合高效液相色谱法检测样品中的苏丹红
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 Sepharose 4FF的活化
• 2.3.2 氨基化苏丹红的制备
• 2.3.3 建立酶联免疫吸附试验检测苏丹红
• 2.3.4 抗苏丹红免疫亲和柱的制备
• 2.3.5 建立免疫亲和柱联合高效液相色谱法检测样品中的苏丹红
• 第三章 小结
• 3.1 琼脂糖凝胶Sepharose 4FF的活化
• 3.2 制备了氨基化苏丹红
• 3.3 活化琼脂糖凝胶Sepharose 4FF的修饰
• 3.4 研制了抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体免疫亲和柱
• 3.5 建立了IAC-HPLC检测苏丹红Ⅰ
• 第四章 讨论
• 4.1 载体的活化和修饰
• 4.1.1 载体活化方法
• 4.1.2 载体的修饰
• 4.2 免疫亲和柱的研制
• 4.2.1 抗体的纯化
• 4.2.2 偶联
• 4.2.3 保存
• 4.3 高效液相色谱法检测
• 4.3.1 色谱条件
• 4.3.2 加标实验方法
• 本研究的创新之处
• 致谢
• 参考文献