β-巯基乙醇对核移植供体细胞及胚胎发育影响的研究

论文摘要

在哺乳动物体细胞克隆中,从供体细胞制备,受体卵母细胞的培养和去核,重构胚的构建、激活和培养,胚胎移植直到胎儿出生,这个过程中的每个技术环节都会影响克隆效率。而其中,供体细胞和受体细胞的制备以及重构胚构建和培养占有最重要的地位。为提高核移植效率,研究者们曾尝试了很多方法来改善供体细胞和重构胚的培养条件,比如在供体细胞培养液中添加甲基化酶抑制剂,乙酰化酶抑制剂,在重构胚中添加维生素E,谷胱甘肽等。本试验主要从供体细胞的选择,准备和处理,利用β-ME处理体外培养的重构胚方面进行研究,得到主要研究结果如下：1.三种细胞系的建立及MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐）测定细胞活力荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞（BMec）,荷娟杂交牛耳组织成纤维细胞（HJF）的和黄牛耳组织成纤维细胞（YCF）的离体培养。MTT法分别测定三种体细胞的第2,6,13,20代细胞发现：第2和第6代细胞的增殖和生长状况显著比13和20代细胞的要好（P<0.05）,特别是第6代细胞（P<0.01）。2.β-巯基乙醇（β-ME）处理对三种细胞活力的影响用含β-ME分别为0、50、100、150μmol/L的培养液对三种细胞进行处理,然后用MTT法测定OD值,结果显示：添加β-ME100μmol/L时,MTT-OD值显著高于其他组（P<0.05）。说明在此浓度下,荷娟杂交牛耳组织成纤维细胞的活性最高,增殖速度最快。3.β-ME处理对三种细胞抗氧化能力的影响用含β-ME分别为0、50、100、150μmol/L的培养液对三种细胞进行处理,然后用试剂盒测定GSH-Px、SOD、CAT、MDA、T-AOC五种抗氧化指标,结果显示：β-ME浓度为100μmol/L时,GSH-Px、SOD、CAT、T-AOC浓度显著升高（P<0.05）,MDA值显著下降（P<0.05）,说明添加β-ME可以提高细胞的抗氧化能力。4.β-ME对体细胞克隆胚胎的影响血清饥饿诱导荷娟杂交牛耳组织成纤维细胞后,设三个试验：第一组,正常培养情况下的荷娟杂交牛耳组织成纤维细胞为供体进行核移植,重构胚培养液中不添加β-ME,作为空白对照。第二组,正常培养情况下的荷娟杂交牛耳组织成纤维细胞作为供体进行核移植,重构胚培养液中添加同浓度的β-ME。第三组,用含β-ME100μmol/L的培养液处理供体细胞24h,再进行核移植,重构胚培养液中添加同浓度的β-ME。结果显示：第二和第三组的卵裂率和囊胚率显著高于第一组（P<0.05）,而第二和第三组之间差异不显著（P>0.05）,但从数据可以看出,供体细胞经过β-ME处理后得到的卵裂率和囊胚率最高。因此,可以认为,在本实验条件下,培养液中添加β-ME能够提高细胞的活性,在重构胚的培养液中添加β-ME可以提高核移植的效率。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 核移植研究进展与概况
• 1.1 哺乳动物胚细胞核移植研究进展与概况
• 1.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植的研究概况
• 1.3 哺乳动物体细胞核移植的研究进展与概况
• 2 影响胚胎发育的因素
• 2.1 供体细胞
• 2.1.1 不同类型的供体细胞
• 2.1.2 供体细胞的周期
• 2.1.3 不同代数和年龄的供体细胞
• 2.2 受体细胞
• 2.2.1 受体细胞的周期
• 2.2.2 根据供体细胞周期确定受体细胞激活法
• 3 抗氧化剂的研究概况以及在核移植中的研究
• 3.1 抗氧化剂对细胞体外培养的影响
• 3.2 抗氧化剂对胚胎体外发育的影响
• 3.3 巯基乙醇
• 3.3.1 巯基乙醇在生物工程方面的应用
• 3.3.2 小结
• 第二章 供体细胞的准备和处理
• 1 试验材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要器材
• 1.3 试验用各种培养液的配制
• 2 供体细胞的准备和处理
• 2.1 荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞的制备及纯化
• 2.2 荷娟杂交奶牛与黄牛耳组织成纤维细胞的制备
• 2.3 三种供体细胞的处理与测定
• 2.3.1 细胞活力测定
• 2.3.2 抗氧化指标的测定
• 2.4 试验设计
• 2.5 数据统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 三种细胞的细胞形态
• 3.1.1 乳腺上皮细胞（BMec）
• 3.1.2 荷娟杂交牛耳组织成纤维细胞（HJF）
• 3.1.3 黄牛耳组织成纤维细胞（YCF）
• 3.2 三种细胞活力的测定
• 3.3 β-ME对三种细胞的第六代处理后的测定结果
• 3.3.1 MTT测定结果
• 3.3.2 抗氧化指标测定结果
• 4 讨论
• 4.1 β-ME对三种细胞活性和增殖的影响
• 4.2 β-ME对三种细胞抗氧化能力的影响
• 4.2.1 β-ME减少了脂质过氧化产物的产生
• 4.2.2 β-ME提高了细胞抗氧化酶的活性
• 5 小结
• 第三章 添加β-ME对胚胎发育的影响
• 1 试验材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要器材
• 1.3 试验用液的配制
• 2 试验方法
• 2.1 卵母细胞的准备
• 2.2 供体细胞的准备
• 2.3 核移植
• 2.4 重构胚的激活及体外培养
• 2.5 试验设计
• 2.6 试验数据统计分析
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 4.1 供体细胞处理对胚胎发育的影响
• 4.2 β-ME对体外重构胚发育的影响
• 5 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 附表
• 致谢